Produzione e deposizione per aerosol di spore di Bacillus subtilis

Abstract

Fonte: Fuchs, F. M., et al. Indagine sugli effetti dannosi della sterilizzazione al plasma a bassa pressione sulla sopravvivenza delle spore di Bacillus subtilis utilizzando la microscopia su cellule vive. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra la produzione, la purificazione e la deposizione basata su aerosol delle spore di Bacillus subtilis per creare un monostrato uniforme, consentendo applicazioni a valle come l'analisi basata sulla microscopia della germinazione, della vitalità o della risposta allo stress delle spore.

Protocollo

1. Produzione e purificazione di spore di Bacillus subtilis

1. Per la produzione di spore, trasferire una coltura notturna da 5 mL del rispettivo ceppo di B. subtilis , integrata con antibiotici appropriati, in 200 mL di terreno di sporulazione Schaeffer liquido a doppia forza (per litro 16 g di brodo nutriente, KCl (cloruro di potassio) 2 g, 0,5 g di MgSO₄*7 H₂O (solfato di magnesio eptaidrato), 2 mL 1 M Ca(NO₃)₂ (nitrato di calcio), 2 mL 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (cloruro di manganese tetraidrato), 2 mL 1 mM FeSO₄ (solfato ferroso), 2 mL 50% (p/v) glucosio18) e coltivarlo con aerazione vigorosa a 37 °C per 72 h o fino a > il 95% della coltura ha sporulato. Vengono utilizzate le spore dei seguenti ceppi: B. subtilis PY79 (wild type) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (carente della proteina di riparazione del DNA RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA fuso con la proteina fluorescente gialla [YFP]).
2. Raccogliere le spore mediante centrifugazione per 15 minuti a 3.000 x g in provette da 50 mL e purificare i campioni mediante ripetute fasi di lavaggio (fino a 15 volte) utilizzando H₂O distillato sterile e verificare la purezza e lo stato di germinazione mediante microscopia a contrasto di fase. Assicurarsi che le sospensioni di spore siano costituite da spore brillanti di fase (> 99%) e siano prive di cellule vegetative (bastoncelli), spore germinate (aspetto nero/grigio) e detriti cellulari; In caso contrario, ulteriori esperimenti di microscopia possono essere disturbati. Lavare il campione fino a raggiungere la purezza desiderata.
3. Determinare il titolo di spore impiattando 50 μL di diluizioni seriali 10 volte su LB (luria-bertani)-agar (ad esempio: utilizzare 30 μL di campione + 270 μL di acqua sterile per una diluizione 1:10. Prelevare 30 μL dalla particolare diluizione a 270 μL H₂O per una diluizione 1:100 e così via) per calcolare le CFU (unità formanti colonie) e incubare le piastre a 37 °C per una notte. Dopo la determinazione delle UFC, regolare il campione a^10-9 spore per mL concentrandolo o diluendolo con acqua sterile.

2. Preparazione del campione di spore di Bacillus subtilis depositate tramite aerosol

NOTA: L'accumulo e la sovrapposizione di spore potrebbero portare a effetti di ombreggiamento durante il trattamento, con conseguente falsificazione della cinetica di inattivazione. Per ridurre al minimo questo problema, preparare campioni di spore con una tecnica di deposizione di aerosol. In breve, controllare l'ugello a due sostanze ad alta precisione con un timer elettrico che regola la portata del liquido di concerto con il flusso di gas di trasporto pressurizzato (qui N₂). Disperdere il campione liquido iniettato attraverso l'uscita dell'ugello utilizzando il flusso di azoto gassoso.

1. Posizionare un supporto per campioni sotto forma di vetrini microscopici sterilizzati (per la cinetica di sopravvivenza) o di vetrini coprioggetti rotondi da 25 mm (per il tracciamento fluorescente dei processi di riparazione del DNA/cLSM; microscopia a scansione laser confocale) all'interno dell'unità di spruzzatura di aerosol ad azionamento elettrico in allineamento con l'ugello. La concentrazione di spore utilizzata deve corrispondere a cento volte la concentrazione finale desiderata.
2. Trasferire 1 mL di coltura di spore all'ingresso del fluido dell'ugello e avviare il processo di spruzzatura di 0,1 s a una pressione di 1,3 bar. La sospensione di spore spruzzata (1 x 10⁷) forma un film sottile sul vetrino microscopico che si asciuga rapidamente in pochi secondi per formare un monostrato di spore uniformemente distribuito. Conservare i portacampioni trattati in un contenitore sterile a temperatura ambiente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ugello a due sostanze (modello 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, diametro foro 0,8 mm
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Connettori per tubi	Festo	n/a	G 1/8
Vetrini	VWR	48300-026
Camera cellulare Attofluor	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, rotondo
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma Aldrich	13152
Nitrato di calcio	Sigma Aldrich	202967
Cloruro di manganese tetraidrato	Sigma Aldrich	244589
Solfato ferroso	AppliChem	13446-34-9
Glucosio	Merck	215422
Cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Brodo nutriente (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
piastra a 96 pozzetti	ThermoFisher	243656