Analisi di fattibilità di Microcystis aeruginosa mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Chapman, I. J., et al., Ottimizzazione della sonda molecolare per determinare la mortalità cellulare in un organismo fotosintetico (Microcystis aeruginosa) utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra il metodo per distinguere le cellule vive e morte di Microcystis aeruginosa combinando l'etichettatura della sonda fluorescente con l'analisi citofluorimetrica dell'autofluorescenza della ficocianina e del segnale della sonda.

Protocollo

1. Ottimizzazione dell'assorbimento delle cellule a sonda molecolare

1. Raccogli metà della coltura di M. aeruginosa da una fase esponenziale e usala come controllo "vivo".
   NOTA: I campioni diluiti da una coltura ad alta densità direttamente a una fase esponenziale possono influenzare i risultati dell'ottimizzazione attraverso il turnover delle cellule morte rispetto alle colture inoculate da una fase iniziale di ritardo/induzione.
2. Preparare l'altra metà come controllo "morto" utilizzando metodi come etanolo al 70%, riscaldamento di campioni a 60 ^oC per 1 ora, paraformaldeide o formaldeide al 4% per 30 minuti. Controllare le variazioni nel microambiente dei campioni (ad es. pH).
   NOTA: Il controllo positivo, ucciso dal calore, "morto" in M. aeruginosa si distingue da un campione "vivo" per la sua diminuzione dei segnali di ficocianine. Indurre la mortalità con altri metodi potrebbe non causare la stessa produzione e varierà nelle specie.
3. Impostare campioni misti utilizzando diversi rapporti di campioni "vivi" e "morti" (ad esempio, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Disaggregare la formazione di colonie mediante vortice o sonicazione e controllare il pH.
5. È possibile selezionare un laser a 488 nm insieme a rivelatori in grado di registrare la fluorescenza dalle sonde di acido nucleico verdi (canale di fluorescenza 1 o FL1, 530 ± 15 nm) e arancioni (canale di fluorescenza 2 o FL2, 585 ± 20 nm) e dal laser a 640 nm per registrare i segnali di ficocianina attraverso il rispettivo rivelatore.
   NOTA: Quando è legata al DNA, la sonda per acido nucleico verde ha una lunghezza d'onda di eccitazione per fluorescenza approssimativa di 504 nm e massimi di emissione di 523 nm, mentre la sonda per acido nucleico arancione ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 547 nm e massimi di emissione di 570 nm. Un laser a stato solido a ioni argon da 488 nm può essere impiegato per eccitare entrambe le sonde molecolari, tuttavia, un laser verde (fino a 547 nm) produrrà una fluorescenza arancione più elevata.
6. Come punto di partenza, introdurre la sonda molecolare alla concentrazione consigliata dal produttore nella coltura 50% "viva" e 50% "morta" e incubare al buio.
7. Selezionare una nuova cella dati, posizionare il campione sotto la porta di introduzione del campione (SIP) con soglie e trigger che ridurranno il rumore di fondo (FSC-H o altezza di dispersione in avanti, 80.000).
8. Crea un grafico di densità con i parametri FSC-H e SSC-H (altezza di dispersione laterale) e tre istogrammi. Un istogramma utilizzando il rispettivo canale del rivelatore ottico a sonda molecolare (FL1 o 2), uno per rilevare le emissioni di ficocianina (altezza del canale di fluorescenza 4 o FL4-H) e l'altro, FSC-H, il tutto su scala logaritmica.
9. Incubare i campioni di M. aeruginosa con le sonde di acido nucleico al buio per un massimo di 60 minuti, registrandoli in celle di dati separate in vari punti temporali (1, 5, 10, 15, 30 e 60 minuti).
   NOTA: Quando si regolano parametri come il pH, verificare con i produttori la presenza di potenziali reazioni da determinate sostanze chimiche (per le sonde di acidi nucleici testate, un tampone non può contenere fosfati o alti livelli di cationi monovalenti o bivalenti, poiché il legame con il DNA sarà ridotto).
10. Applicare un gate software per includere solo l'istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000) per le dimensioni delle cellule dell'organismo bersaglio nel rispettivo istogramma del canale della sonda a fluorescenza.
    NOTA: Le concentrazioni utilizzate in questo protocollo erano 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 μM, che possono essere modificate aumentando o diminuendo il volume del campione di M. aeruginosa o la soluzione madre iniziale delle sonde nucleiche.
11. Nel canale della sonda a fluorescenza, applicare un altro gate software inclusivo al picco più alto dell'istogramma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, arancione FL2-H, 30.000 - 165.000) e successivamente inserire la fluorescenza positiva della sonda nel grafico della densità.
12. Eseguire i passaggi 3.1 - 3.11 con campioni di coltura "vivi" al 100%, "morti" al 100% e a tutti i campioni di coltura mista, regolando le concentrazioni della sonda molecolare (ad esempio, da x 0,1 a x 10) e/o i livelli di temperatura e pH, se necessario.
13. Confrontare il numero di segnali di fluorescenza della sonda molecolare positivi con la densità cellulare originale delle cellule "morte" (prelevata dalla metà dell'FSC-H totale o da una coltura "morta" al 100%) per trovare la percentuale totale di cellule colorate con le sonde di acido nucleico.
14. Eseguire questa operazione per ogni periodo di tempo all'interno di ciascuna concentrazione per trovare il protocollo ottimale per la più alta percentuale di assorbimento della sonda nucleica cellulare senza produrre colorazione non specifica (utilizzare i mezzi in un'analisi unidirezionale della varianza, ANOVA o un'analisi unidirezionale della varianza di Kruskal-Wallis se i dati non sono parametrici).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cianobatteri Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Soluzione concentrata di acqua dolce (diluizione x50)
Fluido di decontaminazione	BD Bioscienze	653155	Eseguire per 2 minuti quando le uscite sono superiori a 12 eventi al secondo in modalità veloce o con una portata di 66 μl/min. Seguito da 2 min di guaina H2O.
Citometro a flusso	BD Bioscienze	su richiesta	BD Accuri C6
SYTOX Verde	Tecnologie per la vita	S7020	Colorante di acido nucleico – 5 mM di soluzione in DMSO
SYTOX Arancione	Tecnologie per la vita	Episodio 11368	Colorante di acido nucleico – 5 mM di soluzione in DMSO