Valutazione dell'attività antimicrobica delle varianti di nisina utilizzando un saggio di diffusione del pozzo di agar

Abstract

Fonte: Nickling, J. H., et.al. Peptidi antimicrobici prodotti mediante incorporazione a pressione selettiva di amminoacidi non canonici. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra un saggio di diffusione di pozzetti di agar utilizzato per valutare l'attività antimicrobica delle varianti di nisina. Mostra come Lactococcus lactis che esprime la peptidasi legata alla membrana NisP attivi i precursori della nisina prodotti in E. coli, con conseguente aloni di inibizione della crescita. La dimensione di questi aloni riflette la bioattività di ogni variante di nisina.

Protocollo

1. Test di attività antimicrobica

1. Preparazione di piastre GM17-agar in condizioni sterili
   1. Preparare una coltura notturna del ceppo indicatore L. lactis NZ9000 contenente il plasmide pNG nisPT a 30 °C in brodo M17 con glucosio all'1% (p/v) (=GM17) e 5 μg/mL di cloramfenicolo.
   2. Misurare OD₆₀₀, inoculare il terreno fresco a OD₆₀₀ = 0,1 e incubare fino a OD₆₀₀ = 0,4-0,6. Quindi posizionare il pallone sul ghiaccio.
      NOTA: Ogni misurazione OD₆₀₀ consumerà volume di coltura. Tenere presente che per ogni piastra di agar per il saggio sarà necessaria una coltura batterica da 1 mL. Se necessario, aumentare di conseguenza il volume di coltura liquida.
   3. Per l'agar all'1,5%, pesare 4,5 g di agar in un flacone di vetro. Aggiungere 300 mL di ddH₂O, mescolare e sterilizzare in autoclave.
   4. Preparare 2x brodo M17 (due volte concentrato) in 300 mL ddH₂O e autoclave.
   5. Mescolare 25 mL di brodo 2x M17 contenente 10 μg/mL di cloramfenicolo e 2% di glucosio con 1 mL di L. lactis pre-coltura (4% v/v).
   6. Aggiungere 25 ml di agar fuso all'1,5% (appena sterilizzato in autoclave o riscaldato nel microonde).
      NOTA: Prima di ciò, lasciare raffreddare il flacone al tatto (circa 50 °C). Ciò è necessario poiché L. lactis è un organismo mesofilo sensibile alle alte temperature.
   7. Versare la soluzione in una grande capsula di Petri. Asciugare le piastre per 10-15 min.
   8. Sterilizzare le estremità di una pipetta di vetro Pasteur alla fiamma. Attendere che si raffreddi, quindi utilizzare l'estremità larga per creare dei fori nell'agar GM17 solidificato.
2. Preparazione del campione
   1. Prelevare 1 mL di colture di espressione di E. coli in una provetta da 1,5 mL marcata e centrifugare per 3 minuti a 7.000 x g. Aspirare il terreno rimanente e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di Na-P (50 mM di tampone fosfato di sodio, pH 7,4 composto da 0,5 M di sodio diidrogeno fosfato e 0,5 M di idrogeno fosfato disodico).
   2. Sonicare i campioni sul ghiaccio. Immergere la punta della sonda del sonicatore nella sospensione cellulare. Impostare il sonicatore al 30 % di ampiezza con impulso di 1 s acceso e 5 s spento per 3 min.
   3. Centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 13.000 x g in detriti di celle in pellet. Trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione su ghiaccio.
   4. Diluire e normalizzare i surnatanti dell'estratto cellulare a 1 mL OD₆₀₀ = 0,6, rispetto alla densità cellulare raccolta, con Na-P.
3. Test di attività
   1. Aggiungere 40 μl di ciascun campione normalizzato in un foro della piastra di agar indicatore (Figura 1). Utilizzare cloramfenicolo a 400 μg/mL come composto di controllo antibatterico. Utilizzare il tampone di eluizione come controllo negativo. Attendere che tutti i campioni siano diffusi nell'agar. Incubare la piastra per una notte a 30 °C.
   2. Scatta foto delle piastre di agar utilizzando uno scanner piano o una fotocamera digitale. Le dimensioni dell'alone di inibizione della crescita possono essere misurate a mano o utilizzando ImageJ.

Risultati

Figura 1. Saggio dell'attività antimicrobica di lisati cellulari contenenti varianti di nisina prodotti tramite SPI con analoghi della prolina. Confronto di varianti di nisina con campioni wild-type rico...

Materiali