Preparazione di un terreno di espettorato artificiale per emulare la fibrosi cistica espettorato polmonare ex vivo

Abstract

Fonte: Vieira, J., et al. Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra la preparazione di un mezzo di espettorato artificiale che imita la viscosità, la composizione dei nutrienti e il pH dell'espettorato polmonare della fibrosi cistica. Il mezzo risultante fornisce una piattaforma fisiologicamente rilevante per gli studi ex vivo.

Protocollo

1. Preparazione del terreno di espettorato artificiale

NOTA: Le quantità qui elencate si riferiscono alla produzione di 1 litro di terreno di espettorato artificiale finale e presuppongono i reagenti specifici elencati nella tabella dei materiali. I numeri devono essere adeguati per altri volumi o per l'uso di reagenti diversi per garantire lo stesso prodotto finale. Vedere la Tabella 1 per le concentrazioni target.

1. Miscela chimica di espettorato artificiale (ASCM)
   NOTA: L'ASCM costituisce il 25% del volume medio finale. È stabile a scaffale e può essere preparato sfuso o in anticipo. Se viene preparato per un uso successivo, sterilizzare in autoclave la miscela chimica e conservarla in modo sicuro a temperatura ambiente.
   1. Miscelare le soluzioni madre chimiche costituenti.
      1. Preparare 1 M di brodo NaCl: aggiungere 58,44 g di NaCl per litro di acqua sterile.
      2. Preparare 1 M di brodo KCl: aggiungere 74,55 g di KCl per litro di acqua sterile.
      3. Preparare 1 brodo M MgSO₄ : aggiungere 246,47 g di MgSO₄·7H₂O per litro di acqua sterile, o 120,37 g di MgSO_{anidro 4} per litro di acqua sterile.
      4. Preparare 1 M di brodo di glucosio: aggiungere 180,16 g di glucosio per litro di acqua sterile.
   2. Sterilizzare in autoclave le soluzioni chimiche madre e un flacone vuoto da 250 ml. Eseguire le fasi di sterilizzazione in autoclave almeno a valori standard di 121 °C e 15 PSI per 30 minuti.
   3. Aggiungere 80,59 ml di acqua sterile al flacone vuoto da 250 ml.
   4. Aggiungere 152,30 ml di 1 M di NaCl alla miscela.
   5. Aggiungere alla miscela 15,8 mL di brodo 1 M KCl.
   6. Aggiungere 610 μl di 1 M MgSO₄ alla miscela.
   7. Aggiungere 700 μl di glucosio 1 M alla miscela.
2. Miscela di mucina di espettorato artificiale (ASMM)
   NOTA: L'ASMM costituisce il 50% del volume finale del mezzo. Assicurarsi che sia preparato lo stesso giorno del lotto medio finale.
   1. Aggiungere 450 ml di acqua sterile in un flacone vuoto da 1 litro.
   2. Aggiungere 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10x nel flacone.
   3. Aggiungere un'ancoretta magnetica usa e getta alla bottiglia.
   4. Autoclavare in autoclave il flacone contenente PBS e l'ancoretta di combustione.
   5. Misurare 10 g di mucina in polvere e aggiungerla al PBS.
   6. Agitare energicamente il flacone per la miscelazione preliminare.
   7. Posizionare la bottiglia su una piastra calda con un agitatore magnetico. Impostare il fuoco su medio-alto, puntando a 50 °C e velocità di agitazione a 1100 giri/min. Aumentare gradualmente la velocità in modo che la barra non voli via dal magnete.
      1. Lasciar scaldare e mescolare per 15 minuti.
      2. Raccogli la bottiglia con guanti resistenti al calore. Osservare per verificare se la polvere di mucina si deposita fuori dalla soluzione.
      3. Se la mucina in polvere non è completamente sciolta, rimettere la bottiglia sul fuoco/agitatore per intervalli di 5 minuti fino a quando non è completamente sciolta.
   8. Lasciare raffreddare la miscela di mucina a temperatura ambiente.
3. Miscela biologica di espettorato artificiale (ASBM)
   NOTA: L'ASBM è il 25% del volume medio finale. Prepararlo lo stesso giorno dell'ultimo lotto medio e, a differenza delle altre miscele, non esporre i suoi componenti a calore.
   1. Scongelare il brodo vitaminico 100x in frigorifero a 4 °C o con ghiaccio. ​
      NOTA: Pre-porzionare il brodo vitaminico in aliquote da 10 ml per ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento/scongelamento.
   2. Aggiungere 124,24 ml di acqua sterile al flacone vuoto da 250 ml sterilizzato in autoclave.
   3. Aggiungere alla miscela 25,76 ml di stock di aminoacidi essenziali 50x.
   4. Aggiungere 80,14 ml di 100x stock di aminoacidi non essenziali alla miscela.
   5. Aggiungere 10 ml di brodo vitaminico (scongelato) 100x alla miscela.
   6. Aggiungere 1 mL di 1000x stock di metalli in tracce alla miscela.
   7. Aggiungere 8,33 ml di emulsione di tuorlo d'uovo al 30% alla miscela.
   8. Aggiungere alla miscela 400 μL di 10 g/L di ferritina.
   9. Mescolare bene la soluzione agitando manualmente.
4. Espettorato artificiale (ASM)
   1. Aggiungere 250 ml di ASCM al flacone da 1 litro contenente ASMM.
   2. Aggiungere 250 ml di ASBM al flacone del terreno.
   3. Titolare il terreno con un tampone MOPS basico (1 M) per raggiungere un pH di 6,3 su carta con pH ristretto. Prima della titolazione, la miscela del terreno risulterà troppo acida.
   4. Refrigerare il terreno di espettorato artificiale risultante a 4 °C fino a quando non è pronto per la filtrazione.
   5. Per avviare il processo di filtrazione, trasferire 200 ml di terreno di espettorato artificiale non filtrato in un sistema di filtrazione sottovuoto con un filtro con pori di 0,22 μm.
   6. Collegare il sistema di filtrazione alla pompa del vuoto, accendere la pompa del vuoto, impostarla a 70 mbar, quindi posizionare la camera su un agitatore orbitale agitando a 90 giri/min in una cella frigorifera a 4 °C.
      1. Rabboccare con altri 150 ml di terreno, poiché viene filtrata una quantità apprezzabile. Ci vogliono 1-2 giorni per filtrare completamente 1 L di terreno.
      2. Ripetere con le camere aggiuntive fino a quando tutto il materiale filtrato è filtrato.
         NOTA: Cerca di non filtrare più di 350 ml di terreno attraverso lo stesso filtro da 0,22 μm poiché la mucina ostruirà il filtro nel tempo.
   7. Conservare in frigorifero il terreno di espettorato artificiale filtrato a 4 °C fino al momento dell'uso. Utilizzare l'ASM entro un mese dalla preparazione per ottenere i migliori risultati.

Tabella 1: Ricetta del terreno di espettorato artificiale derivata da una revisione della letteratura. (Colonna 1) Reagenti e valori chiave nella formulazione del terreno di espettorato artificiale. (Colonne 2-7) Confronto di ricette dalla letteratura esistente. (Colonne 8-9).

Colonna 1		Colonna 2	Colonna 3	Colonna 4	Colonna 5	Colonna 6	Colonna 7	Colonna 8	Colonna 9
Valore		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Fonte
Mucina		2% p/v	0,5% p/v	0,5% p/v	-	1% p/v	2% p/v	1% p/v	Flynn
Cloruro di sodio		85,5 mM	85,5 mM	85,5 mM	66,6 mM	89,8 mM	85,5 mM	152,3 mM	Lapierre
Cloruro di potassio		29,5 mM	29,5 mM	29,5 mM	15,8 mM	-	2,95 mM	15,8 mM	Palmer
Solfato di magnesio		-	-	-	0,6 mM	1 mM	1 mM	0,61 mM	Palmer
Solfato di ferro		-	-	-	0,0036 mM	-	-	-	-
Cloruro di ammonio		-	-	-	2,3 mM	60 mM	-	-	-
Fosfato monopotassico		-	-	-	2,5 mM	60 mM	-	-	-
Glucosio		-	-	-	3,2 mM	13 mM	40 mM	0,7 mM	Sambeek
Lattato		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
Aminoacidi essenziali		14.45x	0,25 g/L	0,25 g/L	Per acido	0,5 volte	0,375 volte	1,29 volte	Palmer
Aminoacidi non essenziali		28,9 volte	0,25 g/L	0,25 g/L	Per acido	0,25 volte	0,5 volte	8.01x	Palmer
Vitamine		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Tracce di metalli		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Tuorlo		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritina		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher
DNA spermatico di salmone		1,4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/L	-	-
DPTA		-	-	0,0059 g/L	-	-	-	-	-
ph		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Immagazzinamento		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Sterilizzazione		Autoclave	Filtro	Autoclave	-	Autoclave	Autoclave	Filtro	Kirchner

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BME Vitamine (100x) Soluzione	MilliporeSigma	B6891	Soluzione concentrata di vitamine supplementari.
Crimpatrice, 30 mm	DWK Scienze della vita	224307	Crimpatrice per il fissaggio di sigilli in alluminio ai flaconi di siero.
D-(+)-glucosio	MilliporeSigma	G7021	Glucosio solido in polvere (isomero destrogiro).
Pompa a membrana ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Pompa a vuoto per filtrazione sottovuoto.
Emulsione di tuorlo d'uovo	HiMedia	FD045	Emulsione sterile di tuorlo d'uovo al 30% in soluzione fisiologica.
Ferritina, cationizzata dalla milza equina	MilliporeSigma	F7879	Soluzione di ferritina (proteina di stoccaggio del ferro).
Bruciatore Bunsen di sicurezza FIREBOY plus	Integra Biosciences	144000	Bruciatore Bunsen con interfaccia utente e funzioni di sicurezza.
Carta pH Hydrion (1,0-14,0)	Laboratorio Micro Essenziale	94	Carta per il test del pH per l'intervallo da 1,0 a 14,0.
Carta pH Hydrion (4,0–9,0)	Laboratorio Micro Essenziale	55	Carta per il test del pH per l'intervallo da 4,0 a 9,0.
Carta pH Hydrion (6,0–8,0)	Laboratorio Micro Essenziale	345	Carta per il test del pH nell'intervallo 6,0-8,0.
Dispositivo di sicurezza Hypodermic Needle-Pro EDGE, 18 g	Smiths Medical	401815	Ferri da 18 g con tappi di sicurezza.
Manometro in linea	MilliporeSigma	20469	Manometro del gas per il monitoraggio della pressione della bombola.
Agitatore incubato Innova 42	Eppendorf	2231000756	Combinazione incubatore/agitatore orbitale.
Siringa Luer-Lok con ago inserito	Becton Dickinson	309580	Combinazione siringa da 3 ml e ago da 18 G.
Assortimento di valvole Luer	Strumenti di precisione mondiali	14011	Valvole per tubi di flusso del gas.
Agitatore orbitale LSE	ThermoFisher Scientifico	6780-NP	Agitatore orbitale per agitare i fluidi durante la filtrazione.
Solfato di magnesio eptaidrato	MilliporeSigma	Visualizzazione del materiale M2773	Sale solido di Epsom (solfato di magnesio eptaidrato).
Regolatore monostadio per aria medica con flussometro	Imprese occidentali	Codice: M1-346-15FM	Regolatore di portata d'aria con contatore da 15 L/min.
Soluzione di aminoacidi MEM (50x)	MilliporeSigma	Motore M5550	Soluzione concentrata di aminoacidi essenziali.
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)	MilliporeSigma	Codice: M7145	Soluzione concentrata di aminoacidi non essenziali.
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	Filtro per siringa sterile con membrana in polietersulfone da 0,22 μm.
Milli-Q Accademico	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Sistema di filtrazione dell'acqua sterile Milli-Q.
Monitor dell'ossigeno MiniOX 3000	MSA	814365	Monitoraggio della percentuale di ossigeno del flusso di gas.
Tampone MOPS (1 m, pH 9,0)	Boston Bioprodotti	BBM-90	Tampone MOPS per la regolazione del pH dei fluidi.
Mucina dallo stomaco suino	MilliporeSigma	Codice: M2378	Mucina (proteina gelificante glicosilata) in polvere.
Cloruro di potassio	MilliporeSigma	P9541	Sale solido di cloruro di potassio.
Ancorette monouso in PTFE	ThermoFisher Scientifico	14-513-95	Ancorette magnetiche monouso.
Nastro in teflon con guarnizione filettata in PTFE	VWR	470042-938	Nastro in teflon per rinforzare i collegamenti dell'impianto del gas.
Cartuccia di purificazione Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	Cartuccia di purificazione per sistema Milli-Q.
Flaconi riutilizzabili per la conservazione dei supporti	ThermoFisher Scientifico	06-423A	Bottiglie per la miscelazione e la conservazione dei terreni di coltura.
Tappo in gomma, 30 mm, grigio bromobutile	DWK Scienze della vita	224100-331	Tappi in gomma per flaconi di siero.
Flacone di siero con graduazioni stampate, 500 mL	DWK Scienze della vita	223952	Flaconi di siero in vetro per colture sigillate.
Set di estensione per fori piccoli	Braun Medical	471960	Prolunga del tubo con connettori luer lock.
Cloruro di sodio	MilliporeSigma	S3014	Sale solido di cloruro di sodio.
Miscela di metalli in tracce, 1000x	ThermoFisher Scientifico	NC0112668	Soluzione concentrata di tracce di metalli fisiologici.
Guarnizione in alluminio sfoderata, 30 mm	DWK Scienze della vita	224187-01	Guarnizioni in alluminio aggraffate sopra i tappi in gomma.