Quantificazione delle unità formanti colonie di batteri associati all'intestino nelle mosche Drosophila

Abstract

Fonte: Dodge, R., et al. Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma di Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra la quantificazione delle unità formanti colonie (CFU) di batteri associati all'intestino nelle mosche di Drosophila utilizzando un approccio seriale di diluizione e piastratura. I campioni di mosca omogeneizzati contenenti batteri intestinali vengono diluiti in serie, piastrati su agar e incubati per consentire la crescita delle colonie. Le immagini delle piastre vengono quindi analizzate utilizzando un software per allineare, segmentare e contare le colonie in ogni punto, consentendo un'accurata quantificazione delle UFC.

Protocollo

1. Omogeneizzazione delle mosche singolarmente in una piastra PCR a 96 pozzetti

1. Preparare in anticipo le piastre del battitore di perline.
   1. Versare le perle di vetro da 0,5 μm (vedere la tabella dei materiali) sul vassoio di misurazione delle perline. Stendere le perline sul vassoio in modo che tutti i pozzetti siano pieni e livellati, quindi spazzolare via le perline in eccesso in un tubo conico per recuperarle.
   2. Posizionare una piastra di reazione a catena della polimerasi (PCR) semi-gonna (vedere Tabella dei materiali) capovolta sul vassoio di misurazione e allinearla con i pozzetti inserendola nella rientranza sul vassoio. Quindi, capovolgilo rapidamente per trasferire le perline.
   3. Rimuovere le perle in eccesso dalla superficie della piastra PCR e coprirla con un foglio. Ispezionare la piastra PCR per assicurarsi che tutti i pozzetti contengano perline. Se necessario, utilizzare un misurino per pesare per aggiungere perline a un singolo pozzetto. Se l'elettricità statica provoca l'adesione di perline sulle superfici della piastra, strofinare o spruzzare il retro del vassoio di misurazione e della piastra PCR con etanolo al 70%.
   4. Coprire con un foglio di alluminio. Molte piastre possono essere preparate in questo modo e poi sterilizzate in autoclave e conservate per un uso successivo. Quando è pronto per l'uso, aggiungere 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ciascun pozzetto utilizzando il pipettatore a 96 canali (vedere la Tabella dei materiali).
2. Sterilizzare in superficie le mosche colonizzate da microbi con etanolo al 70% prima dell'omogeneizzazione.
   1. Anestetizzare le mosche con il 100% di CO₂ per 5 s. Trasferire i moscerini anestetizzati dal flaconcino in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando un piccolo imbuto (Figura 1A-2). In questo studio, in genere sono state aggiunte 25 mosche per tubo.
   2. Spruzzare immediatamente ~1 ml di etanolo al 70% nella provetta, chiudere la provetta e mescolare per inversione per 10 s. Quindi, aspirare l'etanolo con una pipetta P1000, facendo attenzione a non aspirare mosche. Ripetere ancora una volta con etanolo, poi due volte con PBS sterile (Figura 1A-3).
3. Dopo l'ultimo lavaggio PBS, chiudere il tubo e, con il tappo rivolto verso il basso, picchiettare con forza alcune volte sulla panca in modo che le mosche entrino nel tappo.
4. Aprire il tubo ed erogare le mosche nei pozzetti utilizzando una pinza (Figura 1A-4). Posizionare una mosca in ogni pozzetto (Figura 1A-5). Tenere la piastra sul ghiaccio durante il caricamento per mantenere le mosche anestetizzate.
5. Sigillare la piastra utilizzando un foglio termosaldante Thermal Bond (vedere la tabella dei materiali).
   1. Innanzitutto, rimuovi eventuali perle vaganti che si trovano vicino ai pozzetti, poiché possono causare perdite nella guarnizione di alluminio. Assicurati che il lato opaco della pellicola sia orientato verso il basso sulla piastra e il lato lucido verso l'alto verso la termosigillatrice. Premere con decisione la termosigillatrice (vedere la tabella dei materiali) per 5 s (Figura 1A-6). Brunire con l'applicatore manuale (vedi Tabella dei materiali) per fissare la pellicola.
      NOTA: Una scarsa sigillatura è una causa di perdita di campione.
6. Fissare la piastra nell'agitatore per piastre. Omogeneizzare per 5 minuti (Figura 1A-7). Centrifugare la piastra del tallone per 30 s in una mini-piastra spinner (vedi Tabella dei materiali) a 350 x g per rimuovere il liquido dalla pellicola sigillante.
7. Rimuovere la pellicola tenendo la piastra in modo da non schizzare goccioline di omogeneizzato di mosca fuori dai pozzetti.

2. Diluizione seriale dell'omogeneizzato di mosca e spotting su piastre CFU

1. Posizionare quattro piastre rettangolari di crescita in agar de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (vedi Tabella dei materiali) nella cabina di biosicurezza e rimuovere i coperchi. In questo protocollo, l'agar MRS è stato utilizzato per la crescita di L. plantarum. Lasciare asciugare queste piastre per almeno 10 minuti (20 minuti se sono appena versate o fredde dalla conservazione).
   NOTA: Se le piastre sono bagnate, le goccioline della piastra a 96 pozzetti scorreranno insieme e rovineranno i conteggi.
2. Preparare tre piastre di diluizione aggiungendo 100 μl di PBS a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti utilizzando un pipettatore a 96 canali. Caricare un rack di puntali P20 sul pipettatore a 96 canali.
3. Effettuare una diluizione 1:10 aspirando 11,1 μl di omogenato dalla piastra del campione preparata nella sezione 1 (Figura 1A-8). Assicurati di attingere dal centro dei pozzetti piuttosto che dal fondo dei pozzetti perché l'omogeneizzato di mosca e le perle di vetro ostruiscono le pipette. Le perle affondano e il particolato di mosca galleggia, lasciando lo strato intermedio per lo più chiaro.
4. Erogare gli 11,1 μl nella prima piastra di diluizione, che contiene già 100 μl di PBS sterile per pozzetto. Tenere la piastra di diluizione sullo scuotitore per piastre per 10 s a 600 giri al minuto (rpm). Miscelare nuovamente pipettando su e giù per cinque cicli. Trasferire 11,1 μl dalla prima piastra di diluizione alla seconda piastra di diluizione e ripetere le fasi di miscelazione per le due piastre di diluizione successive.
5. Eseguire la diluizione in serie come descritto di seguito.
   1. Recuperare le placche di crescita dalla cappa di biosicurezza.
   2. Iniziando con la piastra più diluita, individuare 2 μl da ciascun pozzetto sulle piastre di agar utilizzando il pipettatore a 96 pozzetti (Figura 1A-9).
      1. Abbassare lentamente la testa del pipettatore sulla piastra, facendo attenzione a non infilzare l'agar. Esaminare attentamente la piastra e assicurarsi che tutti i punti siano stati erogati; in caso contrario, aggiungere manualmente 2 μl nella posizione appropriata. Verificare che le macchie di liquido si impregnino rapidamente nell'agar e non cocleano insieme.
      2. Se le macchie corrono insieme, asciugare una nuova serie di piastre di agar fresche per un periodo più lungo e ripetere la smacchiatura. Se ci sono più tipi di placche (ad esempio, terreni diversi o con antibiotici), individua anche quelle. Erogare nuovamente la soluzione rimanente nella piastra di diluizione e procedere alla successiva concentrazione più alta.
         NOTA: Quando si individuano le diluizioni, miscelare la diluizione successiva cinque volte per assicurarsi che il contenuto dei puntali della pipetta sia stato eliminato dalla diluizione precedente. Le piastre di diluizione possono essere conservate per >8 ore a 4 °C senza influire sulla conta delle colonie.
6. Ripetere il processo di placcatura come descritto al punto 2.5 per le piastre di diluizione rimanenti, passando dalla più diluita alla più concentrata fino alla piastra con l'omogeneizzato originale.
7. Quando tutto il liquido è stato assorbito nell'agar, capovolgere le piastre e metterle nell'incubatrice (Figura 1A-10). Per Lactiplantibacillus e Acetobacter da Drosophila, la temperatura ottimale è di 30 °C su terreni MRS. Incubare fino a quando le colonie non hanno raggiunto la dimensione ottimale: le colonie sono abbastanza grandi da vederle chiaramente, ma non così grandi da fondersi o interferire con la crescita l'una dell'altra (vedere i risultati rappresentativi per la quantificazione della dimensione ottimale).
   NOTA: Le condizioni di crescita ottimali dipendono dalla deformazione e devono essere determinate empiricamente. Per il Lactiplantibacillus di Drosophila, il tempo ottimale di incubazione è compreso tra 26 e 30 ore sull'agar MRS. Per l'Acetobacter da Drosophila, il tempo ottimale di incubazione è compreso tra 30 e 48 ore in MRS, a seconda del ceppo.
8. Dopo l'incubazione, conservare le piastre a 4 °C, se necessario, fino al momento del conteggio.

3. Quantificazione delle unità formanti colonie (CFU)

1. Quantificare i CFU fotografando le piastre e quindi contando le colonie utilizzando un software automatizzato, come descritto di seguito. Se le piastre sono state conservate a 4 °C, lasciarle prima raggiungere la temperatura ambiente in modo che non ci sia condensa sulle lastre, che produce abbagliamento.
2. Organizza le lastre in una sequenza logica e mantienile in quell'ordine durante la fotografia: rende più facile denominare i file. Orientare tutte le piastre in modo che A1 si trovi nell'angolo in alto a sinistra per tutte le piastre. Si consiglia di etichettare l'angolo A1 con un documento d'identità univoco per garantire che le foto non vengano confuse. Impilare ogni serie di diluizione in ordine.
3. Rimuovere il coperchio della piastra e posizionare la piastra sul tavolino con A1 orientato nell'angolo corretto. La scatola fotografica per lastre è ottimizzata per fotografare queste piastre portapiatti e include opzioni di illuminazione e filtro per l'imaging di colonie fluorescenti.
4. Immaginate le lastre. Utilizzare la fotocamera (vedere Tabella dei materiali) con le impostazioni manuali per ottenere un livello di esposizione uniforme tra le lastre. Si consiglia un'impostazione della lunghezza focale lunga per ridurre al minimo la distorsione prospettica. Scatta la foto utilizzando un otturatore remoto per ridurre al minimo la sfocatura dovuta alle vibrazioni della fotocamera.
5. Trasferisci le immagini su un computer e rinominale, includendo il nome dell'esperimento, il tipo di supporto, il fattore di diluizione e qualsiasi altro dettaglio pertinente. Alcuni sistemi operativi (vedere Tabella dei materiali) dispongono di un'utile funzione di ridenominazione batch nel Finder facendo clic con il pulsante destro del mouse su una selezione di file.

4. Conteggio automatico delle colonie utilizzando la suite Count-On-It

1. Ritaglia le immagini utilizzando il plug-in Croptacular fornito per ImageJ. Questo plugin aiuta a dividere l'immagine in una serie ordinata di sottoregioni (ad esempio, 8 x 12 per una piastra a 96 pozzetti). Le sottoregioni saranno conteggiate individualmente.
   1. Organizzare le immagini da elaborare per la quantificazione in una cartella. Scegli i nomi dei file che distinguono le targhe, poiché questi nomi di file diventano titoli di colonna per ogni serie di conteggi. All'interno di questa cartella, crea sottocartelle denominate "ritagliate" e "ricevute".
   2. Avvia Croptacular e fai clic su OK per avviare il ritaglio.
      NOTA: Vengono visualizzate le impostazioni predefinite e di solito sono sufficienti. A seconda della risoluzione dell'immagine, dell'illuminazione, della dimensione dello spot, ecc., può essere utile regolare i parametri di base.
   3. Se l'immagine è già dritta, premi semplicemente la barra spaziatrice. In caso contrario, raddrizza l'immagine tracciando una linea lungo un bordo che dovrebbe diventare orizzontale. Ridisegna la linea tutte le volte che è necessario se l'immagine non appare ancora raddrizzata.
   4. Quindi, disegna una casella di delimitazione dell'area per la quale deve essere effettuato il conteggio. Regola le dimensioni e le proporzioni fino a quando tutte le macchie sono all'interno delle loro celle. Trascinare il cursore all'esterno del riquadro di delimitazione per aggiornare la griglia. Quando la griglia ha un bell'aspetto, premi la barra spaziatrice.
   5. Assicurati che l'immagine successiva ruoti automaticamente alla stessa angolazione della prima; Il plug-in presuppone che tutte le foto siano allineate allo stesso modo. Se questo è corretto, premi la barra spaziatrice per continuare. In caso contrario, raddrizzare l'immagine come prima. La griglia richiama anche la stessa posizione dell'immagine precedente; regolare se necessario, quindi premere la barra spaziatrice.
2. Enumera le colonie sulle piastre utilizzando il plug-in Count-On-It: Gridiron fornito per ImageJ.
   1. Avvia Count-On-It > Gridiron. Utilizzare le stesse impostazioni della griglia di Croptacular. Gli utenti possono raggruppare un'intera cartella, analizzare una singola immagine o iniziare dall'immagine corrente.
   2. Impostate la soglia in base a un valore di intensità pixel superiore e inferiore. Rendi la soglia il più rigorosa possibile pur selezionando tutte le colonie. Idealmente, ci sarà un po' di spazio tra le colonie selezionate, ma il software è in grado di segmentare le bolle in una certa misura. Fare clic su OK nella finestra di dialogo "Azione richiesta" quando la soglia è soddisfacente.
   3. Per esaminare i risultati, ingrandisci e osserva più da vicino il conteggio delle colonie. Facendo clic su Annulla si interromperà il plugin. Fare clic su OK per continuare.
   4. Sulla prima immagine, assicurarsi che sia data l'opzione per procedere o tornare al menu di configurazione, ad esempio, per modificare la dimensione minima della colonia. Per procedere con l'elaborazione batch, fare clic su OK. Quindi, seleziona una cartella per conservare la tabella delle ricevute e dei risultati. Usa la cartella "ricevute" o crea una nuova cartella.
   5. Dopo la prima immagine, le immagini successive avranno per impostazione predefinita la stessa soglia delle impostazioni precedenti. Fare clic su OK per utilizzare queste impostazioni o regolare le impostazioni. Se le foto sono coerenti e l'impostazione è accurata, fai clic su OK nella finestra di dialogo "Azione richiesta".
      NOTA: Una volta completate tutte le immagini del batch, la tabella dei risultati viene salvata automaticamente nella stessa cartella delle ricevute.
   6. Esamina le ricevute di conteggio prodotte dal software e correggi manualmente eventuali errori di conteggio. Il plug-in ImageJ è statisticamente accurato, ma si verificano errori. Verifica le ricevute per esaminare i valori anomali e identificare gli errori di conteggio. Il software salva i dati CFU come file .csv nella stessa cartella delle ricevute.
3. Analizza i dati utilizzando il software preferito dall'utente.

Risultati

Figura 1: Il test di colonizzazione misura le CFU in centinaia di singoli moscerini utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti. (A) Panoramica illustrata del saggio di colonizzazione e del metodo di quantificazione ad alt...

Materiali