Trattamento dei batteri con essudati radicali delle piante per emulare le interazioni pianta-microbi in vitro

Abstract

Fonte: Yi, Y., et al. Interazione pianta-microbi: risposta trascrizionale di Bacillus mycoides agli essudati delle radici di patata. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la preparazione e il trattamento delle colture di Bacillus mycoides per studiare le interazioni pianta-microbi. Delinea i passaggi dalla striatura di una coltura stock e dall'incubazione in mezzo liquido all'esposizione dei batteri agli essudati delle radici delle piante sotto agitazione. Il processo culmina nella raccolta e nel congelamento rapido delle cellule batteriche per la successiva analisi dei cambiamenti di espressione genica indotti dagli essudati.

Protocollo

1. Batteri in crescita

1. Strisciare un ceppo di B. mycoides da uno stock di glicerolo a -80 °C su una piastra di agar Luria-Bertani (LB) e incubare la piastra a 30 °C per una notte.

2. Inoculare un terreno liquido LB con una singola colonia dalla piastra e far crescere la coltura in un incubatore agitante a 200 giri/min durante la notte a
30 °C.

2. Trattamento e campionamento dei batteri

1. Per confrontare la curva di crescita dei batteri trattati con essudati radicali con un controllo negativo, preparare una serie di matracci contenenti 50 mL di terreno liquido LB. Aggiungere 0,5 ml di coltura batterica notturna a tutti i palloni e aggiungere rispettivamente lo 0%, 5%, 10% o 15% (v/v) di essudato radicale o acqua deionizzata sterile al terreno.

2. Utilizzare una coltura con acqua deionizzata invece degli essudati delle radici come controllo. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) ogni 1 ora successiva. Genera una curva di crescita tracciando i valori OD₆₀₀ rispetto al tempo.

3. Diluire una coltura di B. mycoides durante la notte con 90 mL di terreno LB preriscaldato fino a un OD_iniziale di ~ 0,05 in un matraccio da 300 mL. Aggiungere 10 mL di essudati radicali alla coltura e incubare a 30 °C per 1 ora.

4. Utilizzare un trattamento con acqua deionizzata sterile da 10 ml come controllo. Raccogliere le cellule dalla coltura mediante centrifugazione a 9.000 x g per 2 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e congelare immediatamente il pellet in azoto liquido, quindi conservarlo a -80 °C fino al momento dell'uso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ipoclorito di sodio	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15% di cloro attivo
Brodo Luria-Bertani (LB)
Incubatore	Nuovo Brunswick Scientifico	Innova 4000
Spettrofotometro	Thermo Fisher Scientifico	Genesys 20
Azoto liquido
Perle di vetro	Sigma	G8893	0,5 μm
Tubo da 2,0 ml con tappo a vite			Senza RNasi
Tubo Eppendorf da 1,5 ml e 2,0 ml			Senza RNasi
Centrifuga	Eppendorf	5430