Saggio di crescita batterica limitata ai metalli per studiare il ruolo dei geni sensibili ai metalli

Abstract

Fonte: Maurakis, S., et al. Crescita limitata ai metalli di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione di geni sensibili ai metalli e l'acquisizione di metalli da ligandi ospiti. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un saggio di crescita batterica con metalli limitati per studiare il ruolo dei geni sensibili ai metalli. I batteri wild-type e mutanti cresciuti in terreno impoverito di metalli vengono incubati con leganti metallici e la loro crescita viene monitorata utilizzando un lettore di piastre. In condizioni di deplezione di metallo, i batteri wild-type esprimono un recettore di superficie che consente l'assorbimento e la crescita dei metalli, mentre il mutante manca di questo recettore, con conseguente crescita limitata.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni semilavorate CDM (Defined Medium) trattate con Chelex

1. Soluzione madre I
   1. Combinare cloruro di sodio o NaCl (233,8 g), solfato di potassio o K₂SO₄ (40,0 g), cloruro di ammonio o NH₄Cl (8,8 g), idrogeno fosfato dipotassico o K₂HPO₄ (13,9 g) e diidrogeno fosfato monopotassico o KH₂PO₄ (10,9 g) in acqua deionizzata fino a un volume finale di 1 L.
   2. Sterilizzare con filtro la soluzione e aliquotare in provette coniche da 50 mL.
   3. Conservare a -20 °C.
2. Soluzione madre II
   1. Combinare l'acido cloridrico tiamina o HCl (0,2 g), la tiamina pirofosfato-Cl (0,05 g), il pantotenato di calcio (0,19 g) e la biotina (0,3 g) in etanolo al 50% (vol/vol) fino a un volume finale di 1 L.
   2. Aliquotare in provette coniche da 50 mL e conservare a -20 °C.
3. Soluzione madre III
   1. Combinare L-aspartato (4,0 g), L-glutammato (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serina (0,4 g), L-leucina (0,72 g), L-isoleucina (0,24 g), L-valina (0,48 g), L-tirosina (0,56 g), L-prolina (0,4 g), L-triptofano (0,64 g), L-treonina (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagina-H₂O (0,2 g), L-glutammina (0,4 g), L-istidina-HCl (0,2 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lisina (0,4 g) e glutatione ridotto (0,36 g) in 500 ml di acqua deionizzata.
   2. Sciogliere la L-cisteina (0,44 g) e la L-cistina (0,28 g) in un volume minimo (~1 mL) di 1 M HCl e aggiungere alla soluzione di aminoacidi di cui sopra.
   3. Regolare il pH della soluzione con idrossido di sodio 10 N (NaOH) fino a quando tutto il particolato non è disciolto. Il pH finale sarà 10,0-11,0.
   4. Portare il volume finale a 1 L con acqua deionizzata.
   5. Sterilizzare la soluzione con filtro e aliquotare in volumi da 250 mL.
   6. Conservare a -20 °C.
4. Soluzione madre IV
   1. Sciogliere il glucosio (200 g) in acqua deionizzata fino a un volume finale di 1 L.
      NOTA: Potrebbe essere necessario riscaldare la soluzione per sciogliere il glucosio.
   2. Sterilizzare con filtro e aliquotare la soluzione in provette coniche da 50 mL.
   3. Conservare a -20 °C.
5. Soluzione madre V
   1. Combina l'ipoxantina (5,0 g), l'uracile (5,0 g) e il NaOH (4,0 g) in acqua deionizzata fino a un volume finale di 1 L.
   2. Filtrare, sterilizzare e aliquotare in provette coniche da 50 mL.
   3. Conservare a -20 °C.
6. Soluzione VI
   1. Preparare una soluzione di cloruro di calcio diidrato 1 M o CaCl 2-2H₂O (147 g/L) in acqua deionizzata. Filtrare, sterilizzare e conservare a temperatura ambiente (RT).
7. Soluzione madre VII
   1. Preparare una soluzione di solfato di magnesio anidro 1 M (MgSO₄) in acqua deionizzata. Filtrare, sterilizzare e conservare presso RT.
8. Soluzione madre VIII
   1. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 1 M (NaHCO₃) in acqua deionizzata. Filtrare, sterilizzare e conservare presso RT.

2. Preparazione di 4x concentrato sterile e 1x CDM

NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in vetreria sterile trattata con acido o in plastica per evitare la lisciviazione dei metalli nelle soluzioni.

1. Combinare le soluzioni madre I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) con 20,0 g di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e mescolare per mescolare.
2. Regolare il pH a 7,4, quindi portare il volume finale a 500 ml con acqua deionizzata.
3. Lavare la resina Chelex-100 in 1 L di acqua deionizzata per rimuovere i conservanti prima di aggiungerla al concentrato sterile 4x. A tal fine, aggiungere 50 g di resina a 1 litro di acqua deionizzata e mescolare per almeno 1 ora. Rimuovere l'acqua mediante filtrazione sottovuoto e utilizzare questa resina lavata per il passaggio 2.4.
4. Aggiungere 50 g di resina e mescolare lentamente per esattamente 90 minuti.
5. Rimuovere la resina mediante sterilizzazione con filtro e conservare il concentrato sterile 4x a 4 °C.
6. Per preparare una concentrazione di lavoro 1x di CDM, diluire prima il concentrato 4x con acqua deionizzata sterile, quindi aggiungere la soluzione VI (125 μL per 500 mL di soluzione 1x), la soluzione VII (535 μL per 500 mL) e la soluzione VIII (10 mL per 500 mL).
   NOTA: Sebbene tutte le soluzioni madre siano già state sterilizzate, si consiglia di sterilizzare nuovamente con filtro la soluzione 1x dopo la preparazione.

3. Preparazione delle lastre CDM

NOTA: La ricetta seguente fa 1 litro di terreno per piatti, ma è meglio prepararli in volumi più piccoli. Tutto si ridimensiona proporzionalmente.

1. Agarosio lavato
   1. Sciogliere 50 g di agarosio in 1 L di acqua deionizzata, mescolando per 1 ora.
   2. Trasferire la soluzione in un flacone da centrifuga e centrifugare a 1.200 x g per 15 minuti a RT. Versare con cautela il surnatante e gettarlo.
   3. Aggiungere una quantità sufficiente di acqua deionizzata per risospendere il pellet di agarosio, quindi trasferire in un pallone da 1 litro. Portare ad un volume finale di 1 L con acqua deionizzata e quindi mescolare e centrifugare come al punto 3.1.2. Scartare il surnatante.
   4. Aggiungere una quantità sufficiente di etanolo al 100% per risospendere il pellet, quindi trasferire in un nuovo pallone da 1 litro. Portare ad un volume finale di 1 L con etanolo. Mescolare e centrifugare come al punto 3.1.2.
   5. Ripetere il passaggio 3.1.4.
   6. Aggiungere metanolo al pellet di agarosio per risospendere, quindi trasferire in un pallone da 1 litro. Portare ad un volume finale di 1 L con metanolo. Mescolare e centrifugare come al punto 3.1.2.
   7. Ripetere il passaggio 3.1.6.
   8. Trasferire l'agarosio lavato in una teglia foderata con un foglio di alluminio e lasciare asciugare in una cappa aspirante. Una volta asciutto, trasferire in un contenitore privo di metallo per la conservazione a lungo termine.
2. Aggiungere 10 g di agarosio lavato e 5 g di fecola di patate a 750 ml di acqua deionizzata.
3. Autoclave per 30 minuti a 121 °C, 100 kPa sopra la pressione atmosferica.
4. Lasciare raffreddare il terreno a ~65 °C, quindi aggiungere 250 mL di CDM 4X, 250 μL di soluzione VI, 1,07 mL di soluzione VII e 20 mL di soluzione VIII.
5. Se lo si desidera, aggiungere i metalli desiderati prima di versare le piastre. L'aggiunta di chelanti non è necessaria per mantenere le condizioni prive di metalli.
6. Versare in piastre di Petri e lasciare solidificare.

4. Crescita limitata di Neisseria gonorrhoeae

NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni, non è necessario stressare i batteri prima dell'inoculazione del CDM. La fase iniziale di raddoppio in CDM e la successiva diluizione sono sufficienti per esaurire i gonococchi delle loro riserve interne di ferro e zinco. Pertanto, le prime due fasi della seguente procedura vengono condotte utilizzando piastre di agar a base media di Gonococcus (GC) che sono state integrate con l'integratore I di Kellogg e 12,5 μM di nitrato ferrico (Fe(NO₃)₃). Se si desidera uno stress precoce del metallo, si consiglia di preparare piastre di base medie GC senza Fe(NO₃)₃ e con 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piridilmetil) etilendiammina) per la chelazione dello zinco o 10 μM di deferoxammina per la chelazione del ferro. Tutta l'incubazione viene condotta a 37 °C con il 5% di CO₂.

1. Due giorni prima dell'esperimento, il giorno -2, striare i gonococchi dalle scorte di congelamento su piastre medie GC e incubare per non più di 24 ore.
2. Il giorno -1, strisciare singole colonie su piastre medie GC fresche. Prova a farlo 14-16 ore prima dell'esperimento di crescita.
3. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 5-10 ml di CDM 1x a un pallone da 125 ml di slettore da 125 ml lavato con acido e utilizzarlo per cancellare un colorimetro Klett.
4. Utilizzare un tampone sterile con punta di cotone per inoculare CDM da singole colonie sane. Punta a 20 unità Klett.
   NOTA: Se non è disponibile un colorimetro Klett, è adatto anche uno spettrofotometro. Non esiste una formula di conversione universale per le unità Klett in OD, ma è disponibile una guida approssimativa (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Incubare agitando a 250 giri/min fino a circa un raddoppio di massa (40 unità Klett). Questo dovrebbe richiedere tra 1 e 2 ore.
6. A questo punto, le colture vengono nuovamente diluite con l'aggiunta di un volume sufficiente di CDM a raggiungere la metà della densità di coltura iniziale (ad esempio, se 5 ml di coltura sono passati da 20 a 40 unità Klett, 15 ml di CDM lo riporteranno a 10 unità Klett) e la crescita continuerà come nella fase 4.5. La quantità specifica di diluizione posteriore, trattamenti dei metalli, ecc., dipende dalle applicazioni a valle. Di seguito forniamo tre esempi

5. Saggi di crescita con metalli limitati

NOTA: Questi saggi descrivono premiscele di crescita preconfezionate. La preparazione di queste miscele è descritta nella sezione 6.

1. Durante il raddoppio di massa nella fase 4.5, pretrattare i pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti con 10 premiscele. Inoltre, designa tre pozzetti da utilizzare come spazi vuoti. A questi pozzetti, aggiungere 10 μl di premiscela 10x e 90 μl di CDM.
2. Una volta che le colture nei palloni per armi laterali sono raddoppiate, aggiungere 100 μl di ciascuna coltura in un pozzetto inutilizzato nella micropiastra e misurare la densità ottica a 600 nm (OD600). Questo può essere fatto con cuvette in uno spettrofotometro, ma con un numero maggiore di deformazioni all'interno di un saggio, questo può diventare ingombrante e generalmente non è consigliato a meno che lo spettrofotometro non sia in grado di misurare direttamente dal braccio del pallone laterale.
   1. Durante la misurazione del diametro esterno, riposizionare i palloni nell'incubatrice per garantire che i gonococchi rimangano vitali.
3. Calcolare la corretta quantità di diluizione necessaria per portare le colture a OD600 = 0,02. Le premiscele 10x hanno un effetto trascurabile sul diametro esterno e possono essere omesse dal calcolo.
4. Diluire le colture con CDM in piccole provette di coltura e aggiungere un volume sufficiente per diluire le premiscele 10x a 1x nella piastra. Se è disponibile uno scaldapiatti, mantenere la piastra a 37 °C durante il lavoro.
5. Incubare la piastra per 8-12 ore agitandola in un lettore di piastre, effettuando le misurazioni OD600 agli intervalli desiderati.

6. Caricamento di metalli di transferrina, S100A7 e calprotectina e preparazione di 10 premiscele

NOTA: Come per la preparazione CDM, utilizzare vetro o plastica lavati con acido per la preparazione della soluzione.

1. Sciogliere la transferrina umana a 10 mg/mL (125 μM) nel tampone iniziale (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8,4). S100A7 e calprotectina sono sospesi in un tampone costituito da 20 mM di Tris, 100 mM di NaCl, 10 mM di 2-mercaptoetanolo e 1 mM di cloruro di calcio o CaCl₂, pH = 8,0).
   1. Aggiungere la soluzione di ferrazione (100 mM di citrato di sodio, 100 mM di NaHCO₃, 5 mM di cloruro di ferro (III) esaidrato o FeCl 3-6H₂O, pH = 8,4) alla soluzione di transferrina per ottenere una saturazione di ferro del 30% (ad esempio, 75 μL di soluzione di ferrazione sono adatti per 5 mL di transferrina se prodotta a 10 mg/mL).
   2. Aggiungere solfato di zinco (ZnSO₄) a S100A7 o calprotectina con un rapporto molare del 50% rispetto alla proteina per creare una saturazione del 25% (ogni molecola proteica ha due siti di legame del metallo). Possono essere utilizzate preparazioni di 100 μM di S100A7 o calprotectina con 50 μM di ZnSO₄ .
   3. In entrambi i casi, consentire la miscelazione end-over-end per almeno 1 ora per il caricamento del metallo.
2. Preparare 4 L di tampone per dialisi (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7,4). Dividerlo in due volumi separati da 2 L e posizionarne uno a 4 °C.
3. Aggiungere le proteine caricate con metallo in una cassetta per dialisi utilizzando una siringa e dializzare contro il primo volume tampone per 4 ore a RT.
4. Spostare la cassetta sul secondo volume tampone e dializzare per una notte a 4 °C. Dopo questi passaggi, tutti i metalli non legati devono essere rimossi.
   NOTA: Si consiglia un test dell'acido bicinchoninico per determinare le concentrazioni proteiche dopo la dialisi.
5. Utilizzare una premiscela di transferrina 10x per l'utilizzo della transferrina come unica fonte di ferro.
   1. Preparare questa premiscela diluendo il 30% di Fe-transferrina umana e apo-transferrina bovina (preparata a 125 μM come descritto per la transferrina umana, senza la fase di caricamento del ferro) rispettivamente a 75 μM e 30 μM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Una premiscela di controllo positivo sostituisce il 30% di Fe-transferrina con 75 μM di Fe(NO)₃ e una premiscela di controllo negativo omette l'aggiunta di ferro, trattenendo solo l'apo-transferrina bovina. Nel saggio di crescita, diluire 10 μl di questi concentrati con 90 μl di coltura. Le concentrazioni finali sono 7,5 μM 30% di Fe-transferrina umana e 3 μM di apo-transferrina bovina.
6. Utilizzare una versione modificata della premiscela transferrina 10x per l'utilizzo di S100A7 o calprotectina come unica fonte di zinco.
   1. Per una premiscela di controllo positivo, incorporare 50 μM di ZnSO₄ nella premiscela di transferrina. Per un controllo negativo, incorporare 50 μM di TPEN e omettere lo zinco. Quindi, prelevare 10 μl di ciascuno di questi per ogni campione necessario e spostare quel volume in una nuova provetta. Aggiungi a questo metà del volume di PBS sterile. Ad esempio, se 10 pozzetti riceveranno la premiscela di controllo positivo, prelevare 100 μl di premiscela, spostarla in una nuova provetta e aggiungere 50 μl di PBS. Fai lo stesso per il controllo negativo.
   2. Per preparare la premiscela S100A7 o calprotectina, prelevare 10 μl di premiscela di controllo negativo per pozzetto necessario, passare a una nuova provetta e aggiungere metà di quel volume del 25% di Zn-S100A7 o calprotectina. Nel test di crescita, utilizzare 15 μl di premiscela e diluire con 85 μl di coltura. Le concentrazioni finali per le transferrine rimangono le stesse della fase 8.5, con l'aggiunta di 5 μM di Zn, TPEN o S100A7/calprotectina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Palloni da 125 mL	Bellco	Codice 2578-S0030	Deve essere ordinato su misura
2-mercaptoetanolo	VWR	M131	Aperto nella cappa aspirante
Carta da 3 mm	GE Salute	3030-6461	Chiamato "carta da filtro" nel testo
Agarosio	Biolone	BIO-41025	Polvere
Cloruro di ammonio	Sigma-Aldrich	Codice: A9434	Polvere
Transferrina bovina	Sigma-Aldrich	T1428	Polvere
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	C5080	Polvere
Pantotenato di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C8731	Polvere
Calprotectina	N/A	N/A	Ci viene fornito da un collaboratore
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lavare con acqua deionizzata prima dell'uso
Tampone sterile con punta in cotone	Puritano	25-806	Il cotone è migliore del poliestere per questa applicazione
Deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Polvere
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Polvere
Cassetta per dialisi	Termo	66380	Preimmergere nel tampone prima dell'uso
Etanolo	Koptec	V1016	Liquido infiammabile, conservare in armadio per infiammabili
Cloruro ferrico	Sigma-Aldrich	F7134	Irritante, non inalare
Nitrato ferrico nonaidrato	Sigma-Aldrich	F1143	Irritante, non inalare
Base media GC	Difco	228950	Polvere, contiene già agar
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Polvere
HEPES	Pescatore	L-15694	Polvere
Transferrina umana	Sigma-Aldrich	T2030	Polvere
Ipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	Polvere
Colorimetro Klett	Manostato	37012-0000	Utilizza la trasmissione del colore per valutare la densità di coltura
L-alanina	Sigma-Aldrich	Codice: A7627	Polvere
L-arginina	Sigma-Aldrich	E 5006	Polvere
L-asparagina monoidrato	Sigma-Aldrich	Codice: A8381	Polvere
L-aspartato	Sigma-Aldrich	Codice: A9256	Polvere
L-cisteina cloridrato	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1276	Polvere
L-cistina	Sigma-Aldrich	C8755	Polvere
L-glutammato	Sigma-Aldrich	G1251	Polvere
L-glutammina	Sigma-Aldrich	G3126	Polvere
L-istidina monocloridrato	Sigma-Aldrich	H8125	Polvere
L-isoleucina	Sigma-Aldrich	I2752	Polvere
L-leucina	Sigma-Aldrich	L8000	Polvere
L-lisina	Sigma-Aldrich	L5501	Polvere
L-metionina	Sigma-Aldrich	Codice: M9625	Polvere
L-fenilalanina	Sigma-Aldrich	P2126	Polvere
L-prolina	Sigma-Aldrich	P0380	Polvere
L-serina	Sigma-Aldrich	S4500	Polvere
L-treonina	Sigma-Aldrich	T8625	Polvere
L-triptofano	Sigma-Aldrich	Codice: T0254	Polvere
L-tirosina	Sigma-Aldrich	T3754	Polvere
L-valina	Sigma-Aldrich	V0500	Polvere
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M7506	Polvere
Metanolo	VWR	BDH1135-4LP	Liquido infiammabile, conservare in armadio per infiammabili
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	60356	Polvere
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P9791	Polvere
Solfato di potassio	Sigma-Aldrich	P0772	Polvere
Fecola di patate	Sigma-Aldrich	S4251	Polvere
Glutatione ridotto	Sigma-Aldrich	G4251	Maneggiare con cura. Può ossidarsi facilmente.
S100A7	N/A	N/A	Ci viene fornito da un collaboratore
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	Episodio 5761	Polvere
Cloruro di sodio	VWR	470302	Polvere
Citrato di sodio	Pescatore	Episodio 279	Polvere
Idrossido di sodio	Acros Organics	383040010	Altamente igroscopico
Tiamina cloridrato	Sigma-Aldrich	T4625	Polvere
Tiamina pirofosfato	Sigma-Aldrich	C8754	Chiamata anche cocarbossilasi
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Polvere
Tris	VWR	497	Polvere
Uracile	Sigma-Aldrich	U0750	Polvere
Solfito di zinco eptaidrato	Sigma-Aldrich	204986	Irritante, non inalare