Rilevamento dei trasportatori metallici di superficie in Neisseria gonorrhoeae mediante Dot Blot

Abstract

Fonte: Maurakis, S. e Cornelissen, CN Crescita limitata ai metalli di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione di geni sensibili ai metalli e l'acquisizione di metalli da ligandi ospiti. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la procedura per rilevare i trasportatori di metalli superficiali in Neisseria gonorrhoeae cresciuta in condizioni di metallo limitato utilizzando un saggio di dot blot, che coinvolge il legame del ligando, il rilevamento degli anticorpi e la visualizzazione colorimetrica.

Protocollo

1. Rilevamento del legame del ligando da parte di trasportatori metallici a membrana esterna

1. Diluire nuovamente le colture con tre volumi di CDM (terreno definito trattato con chelex).
2. Quindi incubare agitando per 4 ore.
3. Poco prima del segno delle 4 ore, tagliare tre pezzi di carta da filtro e un pezzo di nitrocellulosa alla dimensione approssimativa necessaria per entrare in un apparecchio per macchie a punti. Immergere la nitrocellulosa in acqua deionizzata, quindi assemblare l'apparecchio con carta da filtro sotto la nitrocellulosa.
4. A 4 ore, registrare le densità cellulari e standardizzarle fino a una densità finale appropriata.
5. Pipettare le colture cellulari sulla nitrocellulosa e lasciare che la carta da filtro assorba tutto il liquido.
6. Smontare l'apparecchiatura, lasciare asciugare la macchia e bloccare la membrana di nitrocellulosa per 1 ora in albumina sierica bovina al 5% o latte scremato (p/v) in soluzione salina tamponata con Tris.
7. Rimontare l'apparato di dot blot, sostituendo la carta da filtro con un film di paraffina per creare una tenuta stagna sotto la nitrocellulosa.
8. Diluire il ligando legante il metallo di interesse a 0,2 μM in celle bloccanti e sonda per 1 ora.
9. Aspirare il liquido con l'aspirapolvere, lavare la macchia, quindi seguire le procedure immunologiche standard per sviluppare il segnale. Le fasi di lavaggio possono essere eseguite all'interno o all'esterno dell'apparecchio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Palloni da 125 mL	Bellco	Codice 2578-S0030	Deve essere ordinato su misura
2-mercaptoetanolo	VWR	M131	Aperto nella cappa aspirante
Carta da 3 mm	GE Salute	3030-6461	Chiamato "carta da filtro" nel testo
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Latte scremato in polvere
Albumina sierica bovina	Roche	3116964001	Polvere
Calprotectina	N/A	N/A	Ci viene fornito da un collaboratore
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lavare con acqua deionizzata prima dell'uso
Tampone sterile con punta in cotone	Puritano	25-806	Il cotone è migliore del poliestere per questa applicazione
Apparecchio per macchie a punti	Schleicher & Schwell	10484138	Bloccare il coperchio il più saldamente possibile prima del caricamento del campione
Etanolo	Koptec	V1016	Liquido infiammabile, conservare in armadio per infiammabili
Colorimetro Klett	Manostato	37012-0000	Utilizza la trasmissione del colore per valutare la densità di coltura
Metanolo	VWR	BDH1135-4LP	Liquido infiammabile, conservare in armadio per infiammabili
Nitrocellulosa	GE Salute	10600002	Conservare nella guaina protettiva fino all'uso
S100A7	N/A	N/A	Ci viene fornito da un collaboratore
Cloruro di sodio	VWR	470302	Polvere
Tris	VWR	497	Polvere