Coltura di Haemophilus influenzae non tipizzabile

Abstract

Fonte: Venuprasad, K. et. al., Somministrazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la coltura di Haemophilus influenzae non tipizzabile e la preparazione di un inoculo a dose standardizzata per studi di colonizzazione o infezione a valle.

Protocollo

1. Coltura di Haemophilus influenzae (NTHi) non tipizzabile e preparazione dell'inoculo

1. Posizionare NTHi su una piastra di agar per cioccolato e tenere la piastra capovolta in un incubatore di CO₂ umidificato per una notte a 37 °C e 5% di CO₂. Il giorno seguente, coltiva i batteri nel brodo per infusione di cuore cerebrale. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in un tubo sterile da 1,5 ml.
2. Centrifugare a 4.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS). Ripetere questo passaggio una volta.
3. Trasferire 100 μl della soluzione risospesa in 900 μl di 1x PBS e misurare l'assorbanza della coltura diluita a una lunghezza d'onda di 600 nm in uno spettrofotometro.
4. Determinare la vitalità e le unità formanti colonie (CFU) dell'inoculo coltivando diluizioni seriali 1:10 su piastre di agar di cioccolato e incubando per una notte a 37 °C e 5% di CO₂.
5. Sulla base della vitalità e dei CFU determinati nella fase precedente, regolare l'inoculo a una concentrazione finale di 20 x 10⁶ CFU/ml.

Materiali