Misurazione dei tassi di traduzione errata di Mycobacterium smegmatis utilizzando un sistema reporter GFP/luciferasi

Abstract

Fonte: Chen, Y., et al., Misurazione dei tassi di traduzione errata di micobatteri specifici con sistemi reporter con guadagno di funzione. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un metodo per quantificare l'errata traduzione in Mycobacterium smegmatis utilizzando una GFP inducibile e un sistema reporter di luciferasi mutante secreta. Mostra come viene misurata la luminescenza risultante da un'errata traduzione e confrontata con la fluorescenza GFP per valutare l'impatto di una molecola in esame sull'accuratezza della traduzione.

Protocollo

1. Reporter di nanoluc luciferasi (Nluc)/proteina fluorescente verde (GFP)

NOTA: Per una rappresentazione visiva di questo metodo, vedere la Figura 1.

1. Inoculare il ceppo batterico reporter da stock a -80 °C con 2 mL di terreno 7H9. Agitare a 37 °C per 1 o 2 giorni fino a quando OD₆₀₀ raggiunge la fase stazionaria (OD >3).
2. Subcoltura a 50 mL di terreno 7H9 e crescita fino a quando OD₆₀₀ raggiunge la fase stazionaria tardiva (>4).
3. Prima di aliquotare i batteri in una piastra a 96 pozzetti, aggiungere anidrotetraciclina (ATC) a una concentrazione finale di 50 ng/mL e mescolare bene. L'induzione della coltura di massa garantisce che tutti i pozzetti contengano la stessa quantità di induttore e che l'induzione del reporter sia sincronizzata. Aliquotare i batteri in una piastra trasparente a fondo tondo a 96 pozzetti, con 100 μL di volume in ciascun pozzetto.
4. Per individuare le piccole molecole che influenzano i tassi di traduzione errata, aggiungere il composto alla concentrazione indicata per selezionare i pozzetti. Ai fini di questo protocollo, utilizzare la casugamicina (alle dosi indicate nella Figura 2) come illustrazione. Aggiungere dosi diverse di kasugamicina ai pozzetti selezionati (ogni gruppo sperimentale dovrebbe contenere almeno due repliche biologiche).
5. Agitare e indurre i campioni a 37 °C per 16-20 ore.
   NOTA: È necessario sigillare la piastra con pellicola. Inoltre, tutti i pozzetti di bordo devono essere riempiti con almeno 200 μL di acqua sterile per limitare l'evaporazione dai pozzetti di prova.
6. Prelevare 80 μl da ciascun pozzetto, utilizzando una pipetta multicanale, e trasferire i campioni su una piastra nera a 96 pozzetti (che massimizza la misurazione del segnale di fluorescenza). Misura il segnale GFP con un luminometro con 20 ms come tempo di integrazione.
7. Dopo aver misurato il segnale GFP, centrifugare la piastra a 3.220 x g per 10 minuti. Trasferire 50 μL di surnatante in una piastra a 96 pozzetti a fondo bianco (che massimizza la misurazione del segnale di luminescenza), aggiungere 50 μL di substrato Nluc a ciascun pozzetto, mescolarli bene e misurare la luminescenza con il luminometro con 1.000 ms come tempo di integrazione.
8. Determinare il rapporto Nluc/GFP dividendo i valori di luminescenza Nluc corretti per la fluorescenza GFP: questa misura (in unità arbitrarie) è una misura relativa dell'aspartato per l'errata traduzione dell'asparagina.

Risultati

Figura 1: Schema di misurazione del tasso di traduzione errata Nluc-GFP reporter. Una nuova coltura di M. smegmatis, trasformata con i reporter Nluc e GFP, viene coltivata fino a un volume sufficiente per tutte le piastre da testare (ass...

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