Raccolta di liquido di lavaggio broncoalveolare da un modello murino infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile

Abstract

Fonte: Venuprasad, K., et al. Somministrazione intratracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la raccolta e l'elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare da un topo eutanasia infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile per l'analisi a valle.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF)
   1. Sacrificare il topo mediante lussazione cervicale 24 ore dopo l'infezione.
   2. Aprire la cavità addominale del topo con delle forbici anatomiche, tagliare l'aorta ventrale per farla sanguinare ed esporre la parte ventrale del polmone.
   3. Esporre la trachea e intubarla con un catetere calibro 20. Instillare 0,8 ml di tampone BALF (1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), destrosio allo 0,1%, 10 U/ml di eparina) e raccogliere il lavaggio mediante aspirazione delicata. Ripetere questa procedura tre volte.
   4. Contare il numero totale di cellule in 100 μl di sospensione di BALF utilizzando un emocitometro con ingrandimento 10X con colorazione Trypan Blue.
   5. Preparare i vetrini per la colorazione Giemsa modificata. Aliquotare 100 μl di BALF negli appositi pozzetti della citospin e centrifugare a 500 x g per 5 minuti. Asciugare i vetrini per 10 minuti e colorare le celle utilizzando il colorante Giemsa modificato secondo i protocolli del produttore.
   6. Le cellule rimanenti possono essere utilizzate per analisi successive, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), la microscopia confocale, l'espressione genica e il western blot.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Destrosio anidro	Themo Scientific	R01300
Eparina	Hospira, Inc	RL-3010
Ago per siringa 20/26G	BD	(REF305115/175)
Siringa da 1 ml	BD	RIFERIMENTO 309602
catetere 20GA	BD	RIFERIMENTO 381433
Pinzetta #5 in acciaio inossidabile, lunghezza 11 cm	kentscientifico	INS600095
Tubi a fondo tondo in polistirene da 5 ml	BD	RIFERIMENTO 352058
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Laboratori di luce	A-7001-R
1X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Gibco	10010-023
Tampone di lisi dei globuli rossi (10X)	Bioleggenda	420301