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1. Coltura sincrona di cianobatteri
- Coltura di Synechococcus elongatus PCC 7942 su una piastra sterilizzata di terreno blu-verde 11 (BG 11) (in una capsula di Petri di plastica sterile da 9 cm) contenente l'1,5% (p/v) di agar e lo 0,3% (p/v) di tiosolfato di sodio.
- Porre le piastre in una camera di crescita a 23 °C con un'intensità luminosa di 50 μE/m2/s e sottoporle a cicli di 12 ore di luce/12 ore di buio.
- Trasferire le cellule su piastre di agar BG11 fresche una volta alla settimana.
NOTA: Le colture sull'agar appariranno come bande verdi di cellule in proliferazione attiva dopo una settimana in queste condizioni di coltura. - Prelevare ciuffi verdi di cellule con un anello di filo sterilizzato a fiamma e striare le cellule su una nuova piastra di agar BG11. Fallo su una panchina pulita.
2. Monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza
- Utilizzare le cellule coltivate sulla piastra di agar per 6 giorni per osservare la compattazione del DNA. Raccogliere le cellule dalla piastra al termine del periodo di luce versando 1 mL di soluzione di saccarosio 0,2 M sulle cellule. Ripetere versando la soluzione sulle cellule in modo che la maggior parte delle cellule venga raccolta. Trasferire la soluzione di cellule sospese in una microprovetta per la colorazione del DNA.
- Aggiungere la soluzione di colorante per la colorazione del DNA (ad es. Hoechst 33342) a 500 μL della soluzione cellulare sospesa in una microprovetta fino a una concentrazione finale di 1 μg/mL. Quindi, tenere il tubo al buio per 10 minuti.
- Centrifugare per 1 minuto a 2.000 x g per sedimentare le cellule. Scartare il surnatante e aggiungere 10 μl di soluzione di saccarosio 0,2 M per ottenere una sospensione cellulare densa.
- Trasferire 1 μl della soluzione contenente le cellule colorate in un vetrino, applicare un vetrino coprioggetti e osservare con un microscopio a fluorescenza dotato di filtro ultravioletto (UV) utilizzando una lente dell'obiettivo con un ingrandimento di 100X e olio da immersione.
- Verificare che la compattazione del DNA sia osservata a questo punto nella maggior parte delle cellule.