Sintesi di antigeni proteici di membrana stabilizzati con nanodischi utilizzando un sistema privo di cellule

Abstract

Fonte: Gilmore, S. F., et al. Produzione scalata senza cellule e aggiunta adiuvante a una proteina principale della membrana esterna ricombinante di Chlamydia muridarum per lo sviluppo di vaccini. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la sintesi senza cellule di antigeni proteici di membrana stabilizzati con nanodischi utilizzando un sistema a doppio compartimento. Il dispositivo mantiene le condizioni ottimali per un'efficiente sintesi proteica, un corretto ripiegamento e un'integrazione stabile nei nanodischi.

Protocollo

Produzione cell-free di particelle di nanolipoproteine principali della proteina della membrana esterna e telodendrimeri (MOMP-tNLP) per formulazioni di vaccini a subunità

1. Preparare i MOMP-tNLP utilizzando metodi privi di cellule.
   1. Due ore prima di impostare la reazione cell-free, aprire il kit di espressione proteica procariotica cell-free e scongelare uno dei tamponi di ricostituzione. Una volta scongelato, aggiungere una compressa di cocktail di inibitori della proteasi senza acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e lasciarlo sciogliere completamente.

2. Seguire questo protocollo utilizzando un kit progettato per eseguire reazioni da 5 x 1 mL.

   NOTA: Una produzione tipica di scale-up è di 3 x 1 mL.

   1. Per ogni reazione da 1 mL, aggiungere 525 μL di tampone di ricostituzione al flacone di lisato di E. coli e arrotolare delicatamente per sciogliere. Aggiungere 250 μl di tampone di ricostituzione al flacone contenente additivi di reazione (ad es. adenosina trifosfato, guanosina trifosfato) e arrotolare delicatamente per scioglierlo.
   2. Aggiungere 8,1 mL di tampone di ricostituzione al flacone di reazione, richiudere con un tappo di gomma (fare attenzione a non toccare l'interno del tappo di gomma) e capovolgere/arrotolare delicatamente per sciogliere.
   3. Aggiungere 3 ml di tampone di ricostituzione al flacone della miscela di aminoacidi, richiudere con un tappo di gomma e capovolgere/arrotolare delicatamente per sciogliere.
      NOTA: Fare attenzione a non toccare l'interno del tappo di gomma in quanto ciò può causare contaminazione.
   4. Aggiungere 1,8 ml di tampone di ricostituzione al flacone di metionina, arrotolare delicatamente per scioglierlo e quindi conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
       
3. Preparare la soluzione di reazione.
   1. Al flacone di lisato di E. coli , aggiungere 225 μl di miscela di reazione ricostituita, 270 μl di miscela di amminoacidi ricostituita senza metionina e 30 μl di metionina ricostituita. Inoltre, aggiungere 400 μl della miscela 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)/telodendrimero, 15 μg di plasmide MOMP e 0,6 μg di plasmide Δ49ApolipoproteinA1. Arrotolare/agitare delicatamente per mescolare.
      NOTA: Assicurarsi che entrambi i plasmidi siano costruiti dalla stessa spina dorsale plasmidica. Non vortice.
   2. Prelevare 20 μL della soluzione totale e metterla da parte in una provetta da 1,5 mL per la reazione di controllo che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) (vedi sotto).
       
4. Preparare la soluzione alimentare. Al flacone della miscela per mangimi, aggiungere 2,65 mL di miscela di aminoacidi ricostituiti senza metionina e 300 μL di metionina ricostituita. Arrotolare/agitare delicatamente per sciogliere.
   NOTA: A questo punto, il tampone di ricostituzione inutilizzato e la metionina possono essere rimessi nel congelatore per la conservazione.
    
5. Trasferire 1 mL della soluzione di reazione nella camera di reazione interna fornita nel kit di reazione senza celle e sigillare una volta riempita. Trasferire 10 mL della soluzione di alimentazione nella camera esterna del recipiente di reazione e sigillare.
   NOTA: Non riempire eccessivamente le camere! La presenza di bolle d'aria nella parte superiore sia della camera di reazione interna che della camera di alimentazione interna influenzerà negativamente la reazione. L'eventuale soluzione di reazione rimanente può essere collocata in una provetta da 1,5 mL e lasciata miscelare insieme al recipiente principale.
    
6. Aggiungere 0,5 μl del plasmide di controllo GFP (0,5 mg/mL) alla miscela di reazione da 20 μl precedentemente aliquotata.
   NOTA: Molti kit sono forniti con un plasmide di controllo per scopi di controllo della qualità. La maggior parte dei plasmidi che esprimono GFP con un promotore T7 e un sito di legame ribosomiale di E.coli (RBS) possono essere utilizzati anche come plasmide di controllo.
    
7. Porre la reazione in un agitatore a 300 giri/min, 30 °C per un massimo di 18 ore. Per verificare che la reazione abbia avuto successo, utilizzare una sorgente di luce UV per verificare la fluorescenza dovuta alla sintesi della GFP di controllo (Figura 1) dopo soli 15 minuti di incubazione.
   NOTA: Queste condizioni, in particolare la temperatura, potrebbero dover essere ottimizzate per l'espressione di altre proteine di membrana.

Risultati

Figura 1: Espressione e purificazione di MOMP-tNLP. (A) Immagine di provette contenenti piccole aliquote di una reazione priva di cellule che esprime con successo i controlli GFP che si illuminano sotto sorgente di l...

Materiali