Western blot per la valutazione dell'integrità strutturale di un antigene batterico del vaccino

Abstract

Fonte: Gilmore, S. F. et al. Produzione scalata senza cellule e aggiunta adiuvante a una proteina principale della membrana esterna ricombinante di Chlamydia muridarum per lo sviluppo di vaccini. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra l'uso del Western blotting per valutare l'integrità strutturale della proteina principale della membrana esterna (MOMP) all'interno di complessi vaccinali basati su nanoparticelle. Descrive i passaggi chiave coinvolti nel trasferimento delle proteine, nella marcatura degli anticorpi e nell'imaging a fluorescenza.

Protocollo

1. Western blot

1. Per il western blotting, risolvere la principale proteina della membrana esterna (MOMP) – particelle di nanolipoproteine telodendrimeri (tNLP) mediante SDS-PAGE e trasferire i gel utilizzando un sistema di dry blotting commerciale con impostazioni standard secondo il protocollo del produttore.
   1. Al termine del trasferimento, rimuovere i blot dallo stack e incubare ogni blot per una notte a 4 °C in un tampone bloccante adatto contenente lo 0,2% di Tween 20 e 0,5 mg/mL di anticorpo monoclonale (MAb) 40 o 0,2 mg/mL di anticorpo MAbHIS diretto contro l'His-tag della proteina Δ49ApoA1.
      NOTA: Le diluizioni degli anticorpi utilizzate per il blotting sono 1:1.000 per MAb40 e 1:500-1.000 per gli anticorpi MAbHIS.
   2. Lavare ogni tampone 3 volte per 5 minuti con PBS-T (1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Incubare i blot per 1 ora in tampone bloccante contenente anticorpi secondari coniugati a un fluoroforo (ad es. colorante a infrarossi (IRDye)) a una diluizione di 1:10.000.
   4. Rilavare le macchie 3 volte per 5 minuti con PBS-T. Utilizzare una termocamera a fluorescenza per visualizzare le macchie dopo il lavaggio finale.

Materiali