Preparazione e trasformazione di batteri mediante elettroporazione ad alta tensione

1. Isolamento di co-trasformanti di E. coli

1. Preparare cellule elettrocompetenti del ceppo di E. coli appropriato da trasformare. Trasferire in 1 ml di terreno Luria-Bertani (LB) (triptone, estratto di lievito, NaCl rispettivamente a 10, 5 e 10 g/L) una singola colonia del ceppo prescelto e incubare a 37 °C in condizioni di agitazione a 180 giri/min. Diluire la precoltura 1:500 in 25 ml di terreno LB fresco e incubare la coltura a 37 °C.
2. In fase logaritmica (0,6 O.D. o densità ottica), centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 x g per 20 minuti e risospendere il pellet in acqua glicerica sterile ghiacciata al 10% in metà del volume di coltura originale. Ripetere questo passaggio 4 volte, dimezzando il volume di risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo/acqua e dividere la sospensione cellulare in aliquote da 50 μl. Conservare le aliquote a -80 °C fino a 6 mesi.
3. Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrata con 0,5 mM di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). Scongelare un'aliquota di cellule elettrocompetenti su ghiaccio e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Erogare la miscela in una cuvetta da 0,1 cm adatta all'elettroporazione e applicare 1,8 kV.
4. Trasferire immediatamente le cellule elettroporate in 1 ml di terreno SOC (brodo super ottimale con repressione dei cataboliti) (terreno LB integrato con glucosio allo 0,2% p/v, 10 mM di MgCl₂, 2,5 mM KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione e infine trasferire 100 μl di aliquote in piastre di Petri contenenti LB agar con l'antibiotico appropriato. Incubare O/N a 37 °C.
5. Purifica i trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.