Preparazione e trasformazione di batteri mediante elettroporazione ad alta tensione

Abstract

Fonte: Stefan, A., et al., I benefici multiformi della co-espressione proteica in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra la procedura per trasformare l'Escherichia coli con un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici, compresa la preparazione cellulare, l'elettroporazione, il recupero e la selezione dei trasformanti.

Protocollo

1. Isolamento di co-trasformanti di E. coli

1. Preparare cellule elettrocompetenti del ceppo di E. coli appropriato da trasformare. Trasferire in 1 ml di terreno Luria-Bertani (LB) (triptone, estratto di lievito, NaCl rispettivamente a 10, 5 e 10 g/L) una singola colonia del ceppo prescelto e incubare a 37 °C in condizioni di agitazione a 180 giri/min. Diluire la precoltura 1:500 in 25 ml di terreno LB fresco e incubare la coltura a 37 °C.
2. In fase logaritmica (0,6 O.D. o densità ottica), centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 x g per 20 minuti e risospendere il pellet in acqua glicerica sterile ghiacciata al 10% in metà del volume di coltura originale. Ripetere questo passaggio 4 volte, dimezzando il volume di risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo/acqua e dividere la sospensione cellulare in aliquote da 50 μl. Conservare le aliquote a -80 °C fino a 6 mesi.
3. Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrata con 0,5 mM di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). Scongelare un'aliquota di cellule elettrocompetenti su ghiaccio e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Erogare la miscela in una cuvetta da 0,1 cm adatta all'elettroporazione e applicare 1,8 kV.
4. Trasferire immediatamente le cellule elettroporate in 1 ml di terreno SOC (brodo super ottimale con repressione dei cataboliti) (terreno LB integrato con glucosio allo 0,2% p/v, 10 mM di MgCl₂, 2,5 mM KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione e infine trasferire 100 μl di aliquote in piastre di Petri contenenti LB agar con l'antibiotico appropriato. Incubare O/N a 37 °C.
5. Purifica i trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Sigma-Aldrich	E 1296
Ampicillina	Sigma-Aldrich	Codice: A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	Motore M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Triptone	Sigma-Aldrich	95039
Estratto di lievito	Fluka	70161
Cuvette 0,1 cm	BioRad	1652089	Per elettroporazione
Centrifuga 5415R	Eppendorf
Centrifuga Allegra 21R	Beckman
Elettroporazione Gene Pulser II	BioRad