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1. Isolamento di cotrasformanti di Escherichia coli o E. coli
- Preparare cellule elettrocompetenti del ceppo di E. coli appropriato da trasformare. Trasferire in 1 ml di terreno Luria-Bertani (LB) (triptone, estratto di lievito, cloruro di sodio o NaCl rispettivamente a 10, 5 e 10 g/L) una singola colonia del ceppo prescelto e incubare a 37 °C in condizioni di agitazione a 180 giri/min. Diluire la precoltura 1:500 in 25 ml di terreno LB fresco e incubare la coltura a 37 °C.
- Nella fase logaritmica (0,6 O.D.), centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 x g per 20 minuti e risospendere il pellet in acqua glicerica sterile ghiacciata al 10% in metà del volume di coltura originale. Ripetere questo passaggio 4 volte, dimezzando ogni volta il volume di risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo/acqua e dividere la sospensione cellulare in aliquote da 50 μl. Conservare le aliquote a -80 °C fino a 6 mesi.
- Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrata con acido etilendiamminotetraacetico 0,5 mM (EDTA). Scongelare su ghiaccio un'aliquota di cellule elettrocompetenti e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Erogare la miscela in una cuvetta da 0,1 cm adatta all'elettroporazione e applicare 1,8 kV.
- Trasferire immediatamente le cellule elettroporate in 1 ml di brodo super ottimale con terreno di repressione dei cataboliti (SOC) (terreno LB integrato con glucosio allo 0,2% p/v, 10 mM di cloruro di magnesio o MgCl2, 2,5 mM di cloruro di potassio o KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione e infine trasferire 100 μl di aliquote in piastre di Petri contenenti agar LB con l'antibiotico appropriato. Incubare per una notte (O/N) a 37 °C.
- Purifica i trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.
- Preparare le celle elettrocompetenti dei trasformanti primari e ripetere i passaggi da 1.1 a 1.5 per trasformarsi con ulteriori plasmidi.
- Preparare le scorte di glicerolo dei co-trasformanti. Trasferire una singola colonia in LB integrata con gli antibiotici appropriati, incubare a 37 °C sotto agitazione e, in fase logaritmica (0,6 O.D.), centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 x g per 20 min. Risospendere il pellet in terreno antibiotico LB contenente il 15% v/v di glicerolo. Erogare in aliquote e conservare a – 80 °C.
2. Analisi mutazionale di popolazioni co-esprimenti la subunità ε wild-type della DNA polimerasi III di E. coli e la variante mutagena εD12A
- Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente i vettori pBAD-ε e pGOOD1-εD12A in 1 ml di terreno antibiotico LB. Incubare O/N a 37 °C.
- Diluire la precoltura 1:250 in 3 matracci contenenti terreno fresco (10 ml), aggiungere gli induttori appropriati (arabinosio, isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) o arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno) e incubare a 37 °C per 8 ore. Preparare in parallelo colture non indotte.
- Raccogliere aliquote da 1 ml, quindi diluire 1:500 in nuovi matracci contenenti terreno fresco (10 ml) integrato o meno con gli induttori appropriati. Incubare O/N a 37 °C.
- Ripetere i passaggi 2.2 e 2.3 e raccogliere aliquote da 1 ml.
- Determinare il numero di generazioni che si sono verificate in ogni lingua. Trasferimento su piastre LB, 100 μl di appropriate diluizioni seriali di inoculo e coltura. Incubare O/N a 37 °C. Contare le colonie sulle piastre LB e calcolare il log del numero di cellule presenti nell'inoculo (logI) e nella coltura alla fine della crescita (logC). Per determinare il numero di generazioni, utilizzare la formula: (logC– logI)/0.301.
- Centrifugare a 5.000 x g per 20 minuti e risospendere le cellule in 1 ml di 50 mM di tris(idrossimetil)amminometano cloridrato (Tris-HCl), pH 7,6, 50 mM di NaCl. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere 2-3 gocce di cloroformio e agitare per 20 secondi.
- Determinare l'attività della β-glucosidasi di ciascuna aliquota in una micropiastra a 96 pozzetti, utilizzando p-nitrofenil-β-D-glucopiranoside (PNPGluc) come substrato. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 μl di cellule permeabilizzate e 100 μl di substrato (16 mg/ml di soluzione madre in acqua o H2O). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria nei pozzi. Leggere l'assorbanza a 420 nm, utilizzando un lettore di micropiastre e l'apposito filtro.