Estrazione e purificazione di plastoglobuli da batteri fotosintetici

Abstract

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento di goccioline lipidiche di plastoglobulo da tessuto fogliare vegetale e cianobatteri. J. Vis. Exp. (2022)

Il video dimostra l'isolamento dei plastoglobuli dai cianobatteri. Inizia con una coltura di cianobatteri e procede attraverso la disgregazione cellulare utilizzando la forza meccanica. Il rilascio di pigmenti fotosintetici indica il successo della lisi. Un gradiente di gradino del saccarosio viene quindi utilizzato per separare i componenti cellulari in base alla densità, consentendo ai plastoglobuli a bassa densità di formare una banda distinta nella parte superiore. Questa frazione viene raccolta e conservata per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Isolamento di plastoglobuli grezzi

Estrazione di plastoglobuli grezzi da cianobatteri
1. Coltivare una coltura da 50 mL di Synechocystis sp. PCC 6803 fino alla fase stazionaria (circa 7-10 giorni) e regolare la densità cellulare a una densità ottica a 750 nm (OD₇₅₀) di 2,0 utilizzando uno spettrofotometro. Per le condizioni di coltura, utilizzare terreni BG-11 e coltivare in un incubatore a un'intensità luminosa di 150 μmol di fotoni/m²/s, 2% CO₂, 32 °C e con agitazione continua a 150 giri al minuto (rpm).
2. Per rimuovere i polisaccaridi, lavare le cellule centrifugando la coltura da 50 mL a 6.000 × g per 45 minuti a 4 °C e successivamente rimuovendo il surnatante. Continuare lavando le cellule due volte in 50 mL di tampone A (Tabella 1). Rimuovere un'aliquota dell'omogeneizzato cellulare e metterla da parte prima della centrifugazione per conservarla come campione totale rappresentativo di cellule
3. Risospendere il pellet lavato in 25 mL di tampone A e rompere le cellule utilizzando una cella a pressione francese a 1.100 libbre per pollice quadrato (psi), ripetendo il processo 3× (mettere il campione su ghiaccio tra ogni ciclo per evitare la denaturazione delle proteine) fino a quando il colore lisato cambia da verde a rosso-blu-verde sotto luce bianca. Utilizzare una cella pre-raffreddata ed eseguire questo passaggio nella cella frigorifera.
4. Distribuire l'omogeneizzato risultante tra otto provette per ultracentrifuga da 3 mL riempite fino a un massimo di 2,5 mL in ciascuna provetta e quindi sovrapporlo accuratamente con 400 μL di terreno R, producendo un gradiente a gradini.
5. Bilanciare attentamente le provette aggiungendo altro mezzo R, se necessario, e centrifugare per 30 minuti a 150.000 × g a 4 °C. Il tilacoide e altri organelli più pesanti (compresi i corpi di poliidrossialcanoato) si riempiono, mentre i plastoglobuli saranno facilmente visibili come un cuscinetto giallo e oleoso sopra o vicino alla parte superiore del gradiente di saccarosio (Figura 1C).
6. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi con una siringa e un ago da 22 G e depositarlo in una provetta da 2 mL. Se necessario, raschiare i plastoglobuli dal lato della parete della provetta dell'ultracentrifuga con la punta dell'ago.
7. Continuare con il passaggio 2.2. In alternativa, conservare i plastoglobuli grezzi a -80 °C e purificarli successivamente.

Tabella 1: Ricette tampone per l'isolamento di plastoglobuli da tessuto fogliare vegetale o cianobatteri.

Composizioni tampone ^a
Buffer di macinazione	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di cloruro di magnesio (MgCl₂)
	100 mM di sorbitolo
	5 mM di acido ascorbico ^b
	5 mM di ^{cisteina b} ridotta
	0,05 % (p/v) Albumina sierica bovina (BSA) ^b
R medio	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl₂
Medio R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl₂
	0,2 M di saccarosio
Medio R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl₂
	0,7 M di saccarosio
Buffer A	25 mM HEPES-KOH (pH 7,8)
	250 mM di saccarosio
un. Vengono fornite le concentrazioni finali di ciascun componente tampone.
b. Deve essere aggiunto fresco il giorno dell'isolamento. Mentre i tamponi possono essere preparati il giorno prima dell'isolamento, alcuni ingredienti devono essere aggiunti freschi il giorno dell'isolamento, così come eventuali inibitori della fosfatasi e della proteasi.

2. Raccolta di plastoglobuli puri

Lavorazione dei cianobatteri
1. Produrre un gradiente di saccarosio in quattro provette per ultracentrifuga da 2,5 mL, stratificate prima con 500 μL di plastoglobuli grezzi della fase 1.3 miscelati con 750 μL di terreno R 0,7, quindi sovrapposti con 750 μL di terreno R 0,2.
2. Centrifugare il gradiente di saccarosio a 150.000 × g per 90 minuti a 4 °C. Raccogliere i plastoglobuli puri (Figura 1C) con una siringa e un ago da 22 G dalla fase superiore del gradiente di saccarosio e trasferirli in una provetta da 1,5 mL.
3. Aliquotare i plastoglobuli puri e congelarli in azoto liquido. Conservare direttamente a -80 °C o liofilizzare in polvere secca.

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Risultati

Figura 1: Isolamento e immunoblotting di plastoglobuli e tilacoidi. (A) Un campione rappresentativo di plastoglobulo purificato da Z. mays prima dell'estrazione dal gradiente di saccarosio. (B) Un cam...