Purificazione in gradiente di densità di plastoglobuli cianobatterici

Abstract

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento di goccioline lipidiche di plastoglobulo da tessuto fogliare vegetale e cianobatteri. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'isolamento di plastoglobuli dai cianobatteri utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità del saccarosio, evidenziando la loro natura ricca di lipidi e bassa densità e garantendo la loro conservazione strutturale per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Raccolta di plastoglobuli puri

1. Lavorazione dei cianobatteri
   1. Produrre un gradiente di saccarosio in quattro provette per ultracentrifuga da 2,5 mL stratificate prima con 500 μL di plastoglobuli grezzi della fase 1.3 miscelati con 750 μL di terreno R 0,7, quindi sovrapposti con 750 μL di terreno R 0,2 (Tabella 1)
   2. Centrifugare il gradiente di saccarosio a 150.000 x g per 90 minuti a 4 °C. Raccogliere i plastoglobuli puri (Figura 1C) con una siringa e un ago da 22 G dalla fase superiore del gradiente di saccarosio e trasferirli in una provetta da 1,5 mL.
   3. Aliquotare i plastoglobuli puri e congelarli in azoto liquido. Conservare direttamente a -80 °C o liofilizzare in polvere secca.

Tabella 1: Ricette tampone per l'isolamento dei plastoglobuli dai cianobatteri.

R medio	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl2
Medio R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl2
	0,2 M di saccarosio
Medio R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM di MgCl2
	0,7 M di saccarosio

Risultati

Figura 1: Isolamento e immunoblotting di plastoglobuli e tilacoidi. (A) Un campione rappresentativo di plastoglobulo purificato da Z. mays prima dell'estrazione dal gradiente di saccarosio. (B) Un cam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	Codice: M8266
Saccarosio	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrifuga Optima MAX-TL	Beckman Coulter	Codice A95761