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1. Nutrire i vermi con batteri vivi in coltura liquida
NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per colonizzare i vermi con batteri coltivati in laboratorio in condizioni ben miscelate in coltura liquida. I vermi possono essere colonizzati con singoli isolati provenienti da colture pure (ad esempio, agenti patogeni come l'Enterococcus faecium) o miscele di isolati (ad esempio, comunità minime di microbioma).
- Inizia con vermi adulti sincronizzati lavati con saccarosio in una provetta conica da 15 ml. Lavare i vermi una volta in 12 mL di tampone S e scartare il surnatante.
- Risospendere i vermi lavati nel volume di terreno S necessario per l'esperimento. Considera il volume delle condizioni sperimentali, il numero di condizioni in cui verranno divisi i vermi e le concentrazioni finali di vermi e batteri.
NOTA: L'alimentazione dei vermi varia con la disponibilità batterica e i vermi possono essere stressati dall'affollamento. Per la colonizzazione in coltura liquida, si raccomandano <1000 vermi/mL e >107 CFU/mL; 1011 CFU/mL è considerata densità di alimentazione "ad libitum" su E. coli. - Centrifuga le colture batteriche. Versare il surnatante; L'aspirazione o il pipettaggio possono essere utilizzati per rimuovere il surnatante per i batteri che formano pellet sciolti.
NOTA: Per colture >5 mL, trasferire in provette da 15 mL e centrifugare a ~2800 x g in una grande centrifuga da tavolo per 8-10 minuti. Le colture <5 mL possono essere trasferite in provette da 1,5 mL e centrifugate a 9000 x g per 1-2 minuti in una piccola centrifuga da tavolo. I batteri altamente mobili (ad esempio, molte specie di Pseudomonas) possono dover essere refrigerati a 4 °C per 10-15 minuti per facilitare la formazione di un pellet stabile, e potrebbe essere meglio centrifugare a 4 °C. - Risospendere le colture batteriche in un volume di tampone S e centrifugare nuovamente in pellet. Rimuovere ed eliminare il surnatante come prima.
- Risospendere le colture batteriche nel terreno S alla densità desiderata per l'esperimento, più eventuali antibiotici per la selezione. Gli antibiotici da utilizzare, se presenti, dipenderanno dal profilo di resistenza dei batteri utilizzati per la colonizzazione.
- Utilizzando un puntale per pipetta rivestito con tampone per vermi M9 integrato con Triton X-100 (M9TX-01) allo 0,01%, pipettare delicatamente i vermi su e giù fino a quando i vermi non sono completamente risospesi nel terreno S, quindi trasferirli in provette o pozzetti per piastre per la colonizzazione batterica.
- Aggiungere una sospensione batterica a ciascuna coltura di vermi per raggiungere la concentrazione batterica e il volume finale desiderati.
- Se si utilizza una piastra multipozzetto per la colonizzazione, coprire la piastra con una membrana sigillante sterile a 96 pozzetti permeabile ai gas.
- Incubare agitando a 200 giri/min per evitare che i batteri si depositino durante l'incubazione.
2. Disgregazione meccanica di singoli vermi in un formato a 96 pozzetti
NOTA: Questa sezione descrive un protocollo in formato piastra a 96 pozzetti per la disgregazione meccanica di singoli C. elegans colonizzati battericamente. I primi passi del protocollo descrivono un metodo per eliminare i batteri non aderenti dall'intestino del verme e pulire l'esterno dei vermi utilizzando la paralisi a freddo e lo sbiancamento superficiale. Questi passaggi produrranno vermi adulti vivi e puliti che possono essere distrutti meccanicamente per la quantificazione del contenuto batterico o utilizzati per ulteriori esperimenti. Questo protocollo può essere adattato per quantificare i batteri nei vermi colonizzati in coltura liquida, su piastre di agar o da terreno naturale o microcosmo.
- Mettere un'aliquota di M9TX-01 sul ghiaccio per raffreddare (4-5 volte il numero di campioni in mL).
- Preparare un'aliquota di M9TX-01 + candeggina (ipoclorito di sodio al 6%, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL per campione + 1 mL in più) e mettere in ghiaccio a raffreddare.
- Risospendere ogni campione di verme in 1 mL di M9TX-01 in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare brevemente le provette (2-3 s) in una minicentrifuga a bassa velocità (2.000 x g) a 25 °C per pellettare gli adulti. Pipettare il surnatante e gettarlo, assicurandosi di non disturbare il pellet del verme.
- Utilizzando la centrifugazione, sciacquare i vermi due volte con 1 mL di M9TX-01, quindi una volta con 1 mL di tampone per vermi M9, per ridurre i batteri esterni.
- Elimina i batteri non aderenti dall'intestino del verme.
- Risospendere ogni campione di vermi in 1 mL di terreno S + 2 OP50 ucciso termicamente in una provetta di coltura.
- Incubare a 25 °C per 20-30 minuti per consentire il passaggio di eventuali batteri non aderenti dall'intestino.
NOTA: Ciò eliminerà anche qualsiasi proteina fluorescente extracellulare dal lume e consentirà una visualizzazione più chiara dei batteri marcati che aderiscono all'epitelio intestinale, in particolare quando vengono utilizzati fluorofori acido-resistenti (ad esempio, mCherry, dsRed).
- Vermi candeggina superficiali per eliminare i batteri esterni.
- Sciacquare due volte i vermi spurgati con 1 mL di M9TX-01 freddo ed eliminare il surnatante.
- Lasciare raffreddare le provette per 10 minuti con ghiaccio (preferibile) o a 4 °C. Questo paralizzerà i vermi e impedirà l'ingestione di candeggina.
NOTA: Altri protocolli utilizzano un agente chimico di paralisi come il levamisolo; Si tratta di un approccio consolidato che richiede l'aggiunta di un flusso di rifiuti pericolosi. - Aggiungere 1 mL di tampone per vermi M9 ghiacciato + candeggina non profumata (idrossido di sodio all'8,25%, 1:1000 o 1:2000 v/v) in ciascuna provetta. Lasciare riposare le provette sul ghiaccio (preferibilmente) o a 4 °C per almeno 10 minuti per uccidere i batteri esterni.
NOTA: Non superare la concentrazione di 1:1000 di candeggina. Anche nei vermi paralizzati, può verificarsi la mortalità. - Pipettare il tampone di candeggina e gettarlo; Riportare i tubi nel ghiaccio per assicurarsi che i vermi non riprendano a pompare fino a quando la candeggina non viene eliminata.
- Aggiungere 1 mL di M9TX-01 freddo a ciascuna provetta. Centrifugare per ~5 s in una minicentrifuga (2.000 x g a 25 °C); Riportare i tubi nel ghiaccio. Rimuovere il surnatante e gettarlo.
- Ripetere questa fase di risciacquo con un altro 1 ml di M9TX-01 freddo, scartando il più possibile il surnatante.