Interruzione meccanica di singoli vermi per valutare la variabilità nelle interazioni ospite-batteri

Abstract

Fonte: Taylor, M. N. et al. Utilizzo dei dati di un singolo verme per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni Caenorhabditis elegans-batterio. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la quantificazione della variabilità della carica batterica intestinale nei singoli Caenorhabditis elegans attraverso la disgregazione meccanica. Descrive le fasi per la preparazione del campione, la disgregazione meccanica, la diluizione seriale e il conteggio delle colonie per valutare le differenze nella carica batterica intestinale tra i singoli vermi.

Protocollo

1. Separare le viti senza fine in una piastra profonda a 96 pozzetti con graniglia di carburo di silicio per la rottura meccanica. Preparare la piastra di disgregazione a 96 pozzetti come segue.
   1. Procurarsi una piastra sterile da 2 mL con pozzetti profondi a 96 pozzetti e un coperchio per piastre in silicone da 96 pozzetti abbinato.
      NOTA: È importante utilizzare piastre compatibili con gli adattatori a 96 pozzetti per il disgregatore tissutale. Piccole differenze nelle dimensioni esterne fanno la differenza tra una piastra che può essere rimossa dagli adattatori e una che non può essere rimossa .
   2. Usando una spatola a paletta sterile, aggiungi una piccola quantità di carburo di silicio sterile a grana 36 in ogni pozzetto della piastra che riceverà un verme. Usa abbastanza grana da coprire a malapena il fondo del pozzetto (circa 0,2 g per pozzetto). Un eccesso di materiale renderà difficile far arrivare la punta della pipetta sul fondo del pozzetto durante il recupero del contenuto.
   3. Aggiungere 180 μl di tampone per vermi M9 a ciascun pozzetto.
   4. Etichettare le colonne o le righe per indicare dove andrà ogni campione, quindi coprire la piastra senza stringere con il coperchio della piastra in silicio a 96 pozzetti.
2. Trasferire i singoli vermi nella piastra a 96 pozzetti per l'interruzione.
   1. Spostare con cautela i vermi permeabilizzati in una piccola piastra di Petri (35 o 60 mm) contenente una quantità sufficiente di tampone per vermi M9 integrato con Triton X-100 (M9TX-01) allo 0,01% per riempire la piastra fino a una profondità di ~1 cm.
      NOTA: Se è presente un gran numero di vermi, potrebbe non essere possibile trasferire l'intero campione poiché il liquido si affolla e sarà difficile pipettare i singoli vermi.
   2. Utilizzando un microscopio da dissezione o un altro dispositivo a basso ingrandimento, pipettare i singoli vermi in volumi di 20 μl e trasferirli nei singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
      NOTA: È meglio raccogliere solo vermi appena uccisi. Evita i vermi con una forma rigida e lineare, poiché questi vermi potrebbero essere morti da tempo. Prova a prendere vermi curvi o a forma di S, con una normale fisiologia grossolana e un intestino intatto.
   3. Dopo aver trasferito ogni volume, assicurarsi che il verme selezionato sia stato effettivamente espulso nel pozzo. A tale scopo, pipettare fino a 20 μl di M9TX-01 da un'area libera della piastra di Petri e rilasciare l'intero volume nella capsula; Questo normalmente espellerà il verme se è attaccato alla pipetta. Se il verme è rimasto bloccato, rimuovere 20 μl dal pozzetto e riprovare il trasferimento.
   4. Una volta che tutti i vermi sono stati trasferiti, coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di pellicola sigillante flessibile con supporto in carta disponibile in commercio (2 x 2 quadrati), assicurandosi che il lato con supporto in carta della pellicola sigillante sia rivolto verso il basso sui pozzetti del campione. Fare attenzione a non allungare troppo la pellicola sigillante, altrimenti sarà molto difficile rimuoverla in seguito.
   5. Posizionare leggermente il tappetino sigillante in silicone sopra la pellicola sigillante flessibile; Non premere il coperchio nei pozzetti in questo momento.
   6. Spostare la piastra a 4 °C per raffreddare per 30-60 minuti. In questo modo si eviterà il surriscaldamento durante l'interruzione, che può danneggiare i campioni.
      NOTA: Si tratta di un punto di interruzione nel protocollo. Nella maggior parte dei casi, la piastra può essere lasciata a 4°C per un massimo di 4 ore prima della molatura. Non lasciare i vermi durante la notte, poiché ciò modificherà la conta batterica.
3. Caricare piastre a 96 pozzetti su un disgregatore tissutale per rompere i tessuti dei vermi e rilasciare i batteri intestinali.
   NOTA: (Opzionale) Se si utilizza un numero dispari di piastre da 96 pozzetti per i digesti, è necessario preparare un contrappeso prima di procedere. Utilizzare una piastra vuota e profonda a 96 pozzetti e riempire i pozzetti con acqua fino a quando non pesa come la prima piastra.
   1. Premere saldamente il tappetino sigillante in silicone nei pozzetti per creare una tenuta, assicurandosi che il coperchio sia piatto su tutta la superficie della piastra.
      NOTA: Se la pellicola sigillante flessibile è troppo spessa dopo l'allungamento, sarà difficile fissare il coperchio in silicone in modo che sia piatto in tutti i pozzetti. Ciò si tradurrà in una tenuta insufficiente e in una contaminazione da pozzetto a pozzetto durante l'agitazione.
   2. Fissare le piastre nel disgregatore tissutale utilizzando gli adattatori per piastre a 96 pozzetti. Agitare le piastre per 1 minuto a 30 Hz, quindi ruotare le piastre di 180° e agitare nuovamente per 1 minuto. Ciò contribuirà a garantire un'interruzione uniforme in tutti i pozzetti della piastra.
   3. Picchiettare saldamente le piastre sul banco due o tre volte per rimuovere la sabbia dalla pellicola sigillante flessibile.
   4. Utilizzando una centrifuga di grandi dimensioni con due adattatori per piastre da 96 pozzetti, ruotare le piastre verso il basso a 2400 x g per 2 minuti per raccogliere tutto il materiale sul fondo dei pozzetti.
   5. Rimuovere il coperchio in silicone ed estrarre con cautela la pellicola sigillante flessibile.
      NOTA: Se la pellicola sigillante flessibile si attacca in uno dei pozzetti, utilizzare un puntale per pipetta da 200 μl per rimuoverla. Questo è comune quando il film sigillante flessibile è troppo sottile.
4. Diluire in serie i campioni di vermi digestati in 300 μl in piastre a 96 pozzetti.
   1. Utilizzando un pipettatore a pozzetti multipli impostato su 200 μl, pipettare su e giù più volte lentamente e con attenzione per rimescolare il contenuto dei pozzetti, quindi prelevare la maggior quantità possibile di liquido. Trasferire questo liquido nelle file superiori delle piastre a 96 pozzetti preparate per la diluizione in serie di campioni di vermi interrotti.
   2. Utilizzando un pipettatore a 96 pozzetti impostato su 20 μl, rimuovere questo volume di liquido dalla fila superiore ed erogare nella fila B. Pipettare su e giù 8-10 volte per miscelare. Scartare le punte.
   3. Ripetere il passaggio 4.2, partendo dai campioni 0,1x nella riga B per creare campioni di diluizione 0,01x nella riga C.
   4. Ripetere nuovamente il passaggio 4.2, passando dalla riga C alla riga D.
   5. Piastra su agar solido per la quantificazione batterica. Per i vermi monocolonizzati, è generalmente sufficiente preparare 10-20 μL di gocce di ciascuna diluizione [1x-0,001x] su piastre di agar. Per la colonizzazione multispecie, preparare ogni diluizione separatamente pipettando 100 μl su una piastra di agar da 10 cm; Stendere immediatamente con perline di vetro.

Materiali