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1. Quantificazione della localizzazione polare e dinamica delle componenti Dot/ICM
NOTA: I passaggi seguenti sono progettati per immagini con 0,129 μm per pixel acquisite con binning 2 x 2.
- Quantificazione della polarità per le proteine di fusione sfGFP (superfolder green fluorescent protein) (Figura 1)
- Regola il contrasto dell'immagine in modo che i batteri siano chiaramente visibili. Utilizzare lo strumento regione per posizionare un rettangolo di 0,25 x 1,3 μm2 che inizia dal polo e si estende nel citoplasma. Il rettangolo deve rimanere esattamente all'interno dei bordi batterici.
- Contrassegna almeno 200 batteri e usa il pulsante Regione da mascherare per creare maschere per le regioni di interesse. In Statistiche maschera e Ambito maschera, scegliere Oggetto. Quindi, in Caratteristiche e intensità, contrassegnare Intensità media e varianza.
- Esporta i dati e calcola i punteggi di polarità di ciascun batterio come rapporto tra la varianza e l'intensità media.
- Per le applicazioni ad alta produttività, utilizzare un obiettivo di fase e una configurazione del condensatore appropriata per acquisire immagini con i canali di fase e 488 nm. Assicurati di scegliere campi visivi in cui i batteri sono completamente separati.
- Regolare il contrasto del canale di fase dell'immagine a un livello in cui i batteri siano chiaramente visibili. Apri l'immagine a doppio canale, avvia la finestra Crea maschera segmento e cambia il canale in fase.
- Regolare una soglia appropriata e rimuovere gli oggetti di piccole dimensioni con il pulsante Definisci oggetti . In Migliora maschera, scegliete Rimuovi oggetti bordi e successivamente separate le maschere di batteri adiacenti l'una all'altra.
- Calcolare i punteggi di polarità del segnale nel canale 488 per ciascuna cella come descritto in precedenza nei passaggi 1.1.2-1.1.3.
- Quantificazione della dinamica per le proteine di fusione sfGFP (Figura 2)
NOTA: La dinamica è definita come variazioni di intensità nel tempo e le fasi successive sono progettate per brevi periodi di imaging (cioè diversi minuti). Aggiungere al tampone gli integratori appropriati se si desiderano periodi di imaging più lunghi.- Nella finestra Acquisizione immagine , selezionare Timelapse, immettere il tempo degli intervalli nella casella dell'intervallo e immettere 2 nella casella # di punti temporali . Acquisire due immagini successive di Legionella pneumophila che esprimono la proteina fluorescente di interesse.
- Regola il contrasto dell'immagine fino a quando le celle non sono chiaramente visibili. Seguire la Figura 2A e le descrizioni seguenti per posizionare tre diverse maschere. Usa lo strumento regione per posizionare un quadrato di 0,25 x 0,25 μm al centro di almeno 400 celle.
- Utilizzare il pulsante Regione da mascherare per creare una maschera (maschera 1) dei quadrati di interesse. Crea una nuova maschera vuota (maschera 2) e usa lo strumento pixel o lo strumento poligono per contrassegnare l'intera area della cella di almeno 25 celle casuali, che verranno utilizzate per calcolare lo sbiancamento della fluorescenza. Crea una nuova maschera vuota (maschera 3) e usa lo strumento pennello grande per contrassegnare le aree tra le celle, che verranno utilizzate per la sottrazione dello sfondo.
- In Statistiche maschera e Ambito maschera, scegliere Oggetto per maschera 1 e maschera 2. Quindi, in Caratteristiche e intensità, scegliere Intensità media ed esportare i dati delle due maschere. Per la maschera 3, esportare l'intensità media dell'intera maschera.
- Calcola la variazione dell'intensità della fluorescenza per ogni oggetto nella maschera 1 utilizzando le seguenti formule:
Dove la maschera 1 è un quadrato di 0,25 μm × 0,25 μm posto al centro della cella, la maschera 2 copre l'intera cella, la maschera 3 è lo sfondo tra le celle, t1 è l'intensità media nel primo punto temporale e t2 è l'intensità media nel secondo punto temporale.
