Preparazione della Legionella pneumophila per la tomografia elettronica criogenica

Abstract

Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione dell'imaging di cellule vive e della tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)

Il video descrive come preparare campioni di Legionella pneumophila per la tomografia crioelettronica combinando coltura batterica, marcatura con nanoparticelle d'oro e tecniche di vetrificazione. Il processo preserva le strutture cellulari native e consente l'imaging ad alta risoluzione dei componenti del sistema di secrezione associati alla membrana.

Protocollo

1. Rilevamento della densità di massa sfGFP con Cryo-ET

1. Preparazione del campione, raccolta dati e ricostruzione

1. Far crescere una pesante chiazza di Legionella pneumophila che esprime una proteina Dot/Icm marcata in modo fluorescente su piastre CYE-agar-streptomicina per 48 ore a 37 °C. Risospendere le cellule in ddH₂O a un OD₆₀₀ di 0,7. Aggiungere 5 μl di particelle di oro colloidale (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μl di sospensione cellulare.

2. Pipettare 5 μl della miscela di cellule su una griglia di carbonio forata appena scaricata (R 2/1 su rete Cu 200) e lasciare riposare per 1 minuto. Tamponare con carta da filtro e congelare in etano liquido utilizzando un apparato a stantuffo azionato a gravità.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Particelle di oro colloidale da 10 nm	Aurion	25486
Obiettivo Plan Apo 100x (1,4 NA)	Nikon
ASSI	Sigma-Aldrich	Codice: A9758
Telecamera digitale monocromatica CoolSNAP EZ 20 MHz	Fotometria
Cornice genetica, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientifico	AB-0578
Griglia Holey Carbon R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Nitrato di ferro (III) nonaidrato	Sigma-Aldrich	216828
Telecamera K2 Summit per crio-EM	GATAN
Vetrini coprimicroscopio 22x22 mm	Fisher Scientifico	12-542B
Vetrini coprimicroscopio 24x50 mm	Fisher Scientifico	12-545K
Vetrini per microscopio 25x75x1 mm	Globo scientifico	1380
SlideBook 6.0	Innovazioni di imaging intelligente
Motore leggero Spectra X	Lumencor