Coltura del batterio in rapida crescita Vibrio natriegens

Abstract

Fonte: Wiegand, D. J., Lee, et al., Espressione proteica libera da cellule utilizzando il batterio Vibrio natriegens in rapida crescita. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la coltivazione e la raccolta di Vibrio natriegens, un batterio a crescita rapida, in condizioni di aerazione per preparare pellet batterici per la generazione di estratto grezzo.

Protocollo

Preparazione di Vibrio natriegens Estratto di cellule grezze – Coltura batterica

1. Preparare il terreno di crescita batterica di V. natriegens LB-V2 (brodo di lisogenesi con sali V2) come da Tabella 1. Sterilizzare il terreno di coltura mediante autoclave. Lasciare che il supporto raggiunga la temperatura ambiente (RT). Archiviare i supporti in eccesso su RT.
   CAUTELA: Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati e consultare le istruzioni specifiche del laboratorio quando si utilizza un'autoclave.
2. Utilizzare uno stock di glicerolo di V. natriegens wild-type per inoculare 3 ml di terreno LB-V2. Coltivare per una notte a 30 °C agitando a 225 giri/min.
3. Lavare 1 mL di coltura notturna mediante centrifugazione a 10.600 x g su una centrifuga da banco per 1 minuto. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet risultante e risospendere in 1 mL di terreno LB-V2 fresco.
4. In un pallone di Erlenmeyer autoclavato da 4 L con coperchio sterile, aggiungere 1 L di terreno di coltura LB-V2 fresco. Inoculare utilizzando 1 mL di coltura lavata durante la notte (rapporto di diluizione 1:1.000). Coltivare la coltura a 30 °C agitandola a 225 giri/min.
   NOTA: Le colture di V. natriegens possono essere aumentate o diminuite mantenendo il rapporto di diluizione di 1:1.000. Ad esempio, aggiungere 250 μL di coltura notturna lavata a 250 mL di terreno di crescita LB-V2 fresco in un pallone di Erlenmeyer deflettore da 2 L con coperchio sterile.
5. Monitorare l'OD₆₀₀ della coltura utilizzando uno spettrofotometro. Quando la coltura raggiunge OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 3.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Mettere il pellet sul ghiaccio.
   NOTA: V. natriegens cresce rapidamente, quindi è necessario un attento monitoraggio della coltura. La crescita fino a OD₆₀₀ = 1,0 dovrebbe richiedere circa 1,5-2 ore al rapporto di diluizione 1:1.000.
6. Aspirare il surnatante e conservare immediatamente il pellet batterico risultante a -80 °C o procedere direttamente alla lisi cellulare.
   NOTA: Questo passaggio è un buon punto di arresto; Tuttavia, si consiglia di lavorare il pellet immediatamente o entro 1-2 giorni per ottenere i migliori risultati.

Tabella 1: Reagenti per la preparazione di 1 L di terreno di coltura batterica LB-V2

Tabella 1 A	Preparazione dei terreni di crescita batterica LB-V2
Componente	Quantità (g)	Concentrazione finale (mM)	Volume finale (L)
LB Brodo (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabella 1 B	Preparazione del tampone di lisi S30A
Componente	Quantità (g)	Concentrazione finale (mM)	Volume finale (L)
Soluzione Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-glutammato	2.72	14
K-glutammato	6.10	60
Ditiotreitolo (DTT) - 1 M (mL)	1	2

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da 2 mL	Eppendorf	22363352
HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico)	Sigma	H3375
LB (Luria-Bertani) Brodo (Miller)	Sigma	L3522
Cloruro di magnesio (MgCl₂)	Sigma	Codice: M8266
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma	P9333
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma	S7653
Tris Soluzione (pH 8,0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (Wild-type) Ceppo liofilizzato	ATCC	14048