Preparazione dell'estratto di cellule grezze da Vibrio natriegens

Abstract

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Espressione proteica libera da cellule utilizzando il batterio in rapida crescita Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la preparazione di un estratto cellulare da Vibrio natriegens, un batterio in rapida crescita noto per il suo alto tasso di sintesi proteica. Il pellet batterico viene lavato e risospeso in tampone di lisi prima della sonicazione su ghiaccio per prevenire la degradazione cellulare. Il lisato viene centrifugato per separare i detriti cellulari insolubili e l'estratto cellulare viene raccolto, congelato e conservato per un uso futuro.

Protocollo

1. Preparazione di estratti cellulari grezzi di V. natriegens – Coltura batterica

1. Preparare il terreno di coltura batterica V. natriegens , brodo di lisogenesi versione 2 (LB-V2) come da Tabella 1. Sterilizzare il terreno di coltura mediante autoclave. Lasciare che il supporto raggiunga la temperatura ambiente (RT). Archiviare i supporti in eccesso su RT.
   CAUTELA: Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati e consultare le istruzioni specifiche del laboratorio quando si utilizza un'autoclave.
2. Utilizzare uno stock di glicerolo di V. natriegens wild-type per inoculare 3 ml di terreno LB-V2. Coltivare per una notte a 30 °C agitando a 225 giri/min.
3. Lavare 1 mL di coltura notturna mediante centrifugazione a 10.600 x g su una centrifuga da banco per 1 minuto. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet risultante e risospendere in 1 mL di terreno LB-V2 fresco.
4. In un pallone di Erlenmeyer autoclavato da 4 L con coperchio sterile, aggiungere 1 L di terreno di coltura LB-V2 fresco. Inoculare utilizzando 1 mL di coltura lavata durante la notte (rapporto di diluizione 1:1.000). Coltivare la coltura a 30 °C agitandola a 225 giri/min.
   NOTA: Le colture di V. natriegens possono essere aumentate o diminuite mantenendo il rapporto di diluizione di 1:1.000. Ad esempio, aggiungere 250 μL di coltura notturna lavata a 250 mL di terreno di crescita LB-V2 fresco in un pallone di Erlenmeyer deflettore da 2 L con coperchio sterile.
5. Monitorare l'OD₆₀₀ della coltura utilizzando uno spettrofotometro. Quando la coltura raggiunge OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 3.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Mettere il pellet sul ghiaccio.
   NOTA: V. natriegens cresce rapidamente, quindi è necessario un attento monitoraggio della coltura. La crescita fino a OD₆₀₀ = 1,0 dovrebbe richiedere circa 1,5-2 ore al rapporto di diluizione 1:1.000.
6. Aspirare il surnatante e conservare immediatamente il pellet batterico risultante a -80 °C o procedere direttamente alla lisi cellulare descritta nella sezione 2.
   NOTA: Questo passaggio è un buon punto di arresto; Tuttavia, si consiglia di lavorare il pellet immediatamente o entro 1-2 giorni per ottenere i migliori risultati.

2. Preparazione di estratti cellulari grezzi di V. natriegens – lisi cellulare

1. Preparare il tampone di lisi S30 come da Tabella 1 in acqua deionizzata sterile (DI) e regolare il pH a 7,7 utilizzando acido acetico glaciale.
   CAUTELA: L'acido acetico glaciale deve essere maneggiato con DPI adeguati durante la regolazione del pH.
2. Raffreddare il tampone di lisi S30 a circa 4 °C in frigorifero o su ghiaccio prima di iniziare la procedura di lisi cellulare.
   NOTA: Per un rapido raffreddamento, il tampone di lisi può essere posizionato a -20 °C. Non lasciare che il buffer si congeli.
3. Mettere i pellet di celle sul ghiaccio per 10-20 minuti o fino a completo scongelamento. Risospendere tutti i pellet provenienti dalla stessa coltura da 1 L utilizzando 10 mL di tampone di lisi S30 freddo, quindi trasferire la sospensione in una provetta da 50 mL. Se i pellet non vengono congelati nel congelatore a -80 °C al punto 1.6, procedere direttamente alla risospensione.
   NOTA: Aumentare il volume del tampone di lisi S30 utilizzato per risospendere inizialmente i pellet secondo necessità.
4. Centrifugare la sospensione a 3.500 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Lavare il pellet una seconda volta utilizzando 10 mL di tampone di lisi S30 freddo. Metti il pellet sul ghiaccio.
5. In una cella frigorifera, aggiungere 500 μl di tampone di lisi S30 freddo al pellet nella provetta da 50 mL. Utilizzando un puntale per pipette a foro largo, risospendere il pellet e trasferire con cura l'intera sospensione del pellet in una provetta da 2 mL.
   NOTA: Se non è disponibile una pipetta a foro largo, utilizzare un paio di forbici per tagliare l'estremità di un puntale da 1 ml per aumentare il foro per il trasferimento del pellet.
   1. Trasferire quanto più pellet possibile senza aumentare significativamente il volume; tuttavia, il pellet deve essere risospeso in una quantità di liquido sufficiente per essere sonicato, come indicato da una sospensione omogenea nella provetta da 2 mL. Non riempire eccessivamente la provetta da 2 mL. La sospensione non deve superare 1,5 mL; Dividere in più tubi, se necessario.
6. Tenere il pellet della cella sul ghiaccio e lavorare in una cella frigorifera. Riempire un becher da 600 ml di ghiaccio e posizionare un supporto per provette da 2 ml sopra il ghiaccio.
   NOTA: È utile posizionare il supporto del tubo vicino al lato del becher, in modo che la sospensione del pellet sia visibile nel ghiaccio per monitorare l'avanzamento della sonicazione (vedi Figura 1).
7. Mettere brevemente il pellet sospeso a vortice in una provetta da 2 ml per omogeneizzare le cellule, muovere le provette per rimuovere eventuali cellule sul fondo del tappo e posizionarle nel supporto della provetta con il tappo aperto. Abbassare la punta del sonicatore nella sospensione in modo che si trovi appena sotto la superficie del liquido.
8. Preparare la configurazione della sonicazione come illustrato nella Figura 2 utilizzando un sonicatore e una sonda con un diametro della punta di 1/8 di pollice. Inserire le seguenti impostazioni nel controllo del sonicatore: frequenza 20 kHz e ampiezza del 50%, tempo di accensione dell'impulso: 10 s, tempo di spegnimento dell'impulso: 60 s.
9. Eseguire il protocollo di sonicazione a impulsi per tre cicli. Se il volume totale della sospensione del pellet è > 500 μl, eseguire il protocollo di sonicazione a impulsi sei volte.
   NOTA: Generalmente, 3-6 impulsi sono sufficienti per lisare i pellet di V. natriegens ; A seconda del sonicatore, potrebbero essere necessari ulteriori impulsi. Durante la sonicazione, utilizzare la piattaforma della manopola di regolazione per spostare la sonda su e giù per lisare l'eventuale pellet che potrebbe essersi depositato sul fondo del tubo. Il tubo può essere rimosso dal supporto e agitato brevemente per omogeneizzare nuovamente la sospensione tra gli impulsi.
   CAUTELA: Indossare un'adeguata protezione dell'udito quando il sonicatore è attivo.
10. Dopo la sonicazione, centrifugare l'estratto di cellule grezze a 16.000 x g per 30-45 minuti a 4 °C o fino a quando il lisato non è privo di detriti cellulari, come illustrato nella Figura 3.
11. In una cella frigorifera, aliquotare 50 μL dei surnatanti risultanti in nuove provette da 2 mL senza disturbare il pellet.
    NOTA: Eventuali detriti trasferiti accidentalmente nelle nuove provette da 2 ml ridurranno drasticamente la capacità dell'estratto di sintesi proteica ad alto rendimento.
12. Congelare gli estratti di cellule grezze posizionando le provette in un supporto per provette con una corda di immersione attaccata, come illustrato nella Figura 4. Immergere le provette in un Dewar contenente azoto liquido e metterle immediatamente in congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso. CAUTELA: Utilizzare DPI appropriati per la manipolazione dell'azoto liquido, tra cui camice da laboratorio, occhiali di sicurezza, visiera, grembiule criogeno e guanti.

Tabella 1: Reagenti per la preparazione di 1 L di terreno di crescita batterica LB-V2 e 0,5 L di tampone di lisi cellulare S30A.

Tabella 1 A	Preparazione dei terreni di crescita batterica LB-V2
Componente	Quantità (g)	Concentrazione finale (mM)	Volume finale (L)
LB Brodo (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabella 1 B	Preparazione del tampone di lisi S30A
Componente	Quantità (g)	Concentrazione finale (mM)	Volume finale (L)
Soluzione Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)*	25	50	0.5
Mg-glutammato	2.72	14
K-glutammato	6.10	60
Ditiotreitolo (DTT) - 1 M (mL)*	1	2

Risultati

Figura 1: Una vista ravvicinata del becher e del supporto della provetta sulla piattaforma di sonicazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da 15 mL	Corning	352196
Provette da 2 mL	Eppendorf	22363352
Provette da 50 mL	Corning	352070
Fiaschetta Dewar - 4L	TermoScientifico	10-194-100C
Acido L-glutammico, sale di emimagnesio, tetraidrato	Sigma	49605
Acido L-glutammico sale di potassio monoidrato	Sigma	G1149
LB Brodo (Miller)	Sigma	L3522
Cloruro di magnesio (MgCl₂)	Sigma	Codice: M8266
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma	P9333
Pellet di idrossido di potassio	Sigma/Roche	1050121000
Sonicatore Q125 e sonda CL-18	Qsonica	4422
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma	S7653
Vibrio natriegens (Wild-type) Ceppo liofilizzato	ATCC	14048