Espressione proteica libera da cellule utilizzando un estratto di cellule grezze batteriche

Abstract

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Espressione proteica libera da cellule utilizzando il batterio in rapida crescita Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra l'uso di un sistema di espressione proteica batterica priva di cellule basato sul lisato grezzo di Vibrio natriegens per eseguire trascrizioni e traduzioni accoppiate in vitro. Mette in evidenza la preparazione di una miscela master con componenti essenziali e la sintesi graduale di proteine funzionali da un modello di DNA.

Protocollo

1. Preparazione dei componenti di reazione privi di cellule

1. Componenti generali di reazione
   1. Preparare le scorte di Mg-glutammato e K-glutammato in provette da 50 mL con acqua sterile DI (deionizzata) a concentrazioni rispettivamente di 100 mM e 2000 mM.
   2. Preparare una riserva di lavoro di polietilenglicole (PEG)-8000 al 50% (p/v) aggiungendo 100 mL di acqua deionizzata sterile a un becher da 250 mL. Inserire un piccolo agitatore magnetico nel becher. Pesare 50 g di PEG-8000 e aggiungerlo ai 100 mL di acqua nel becher.
   3. Posizionare il becher su una piastra di agitazione riscaldata impostata a 100 °C e mescolare a 250 giri/min fino a quando PEG-8000 non è in soluzione. Lasciare raffreddare la miscela liquida PEG-8000 prima di trasferirla in provette da 50 mL.
2. Master mix di soluzioni energetiche
   1. Preparare una soluzione 5 M di KOH aggiungendo 140 g di pellet KOH a 500 ml di acqua deionizzata sterile.
      CAUTELA: Preparare questa soluzione in una cappa chimica e indossare DPI quando si maneggiano basi resistenti. La soluzione si surriscalda, quindi il tappo del flacone deve essere allentato per evitare l'accumulo di pressione. Lasciare che la soluzione KOH raggiunga RT prima dell'uso.
   2. Preparare un tampone HEPES-KOH da 1750 mM aggiungendo 20,85 g di HEPES in un flacone da 100 mL. Aggiungere lentamente acqua deionizzata sterile fino a quando il volume raggiunge i 40 ml. Bottiglia a vortice per sciogliere l'HEPES. Utilizzare la soluzione 5 M KOH per regolare il pH a 8,0 e quindi portare il volume della soluzione a 50 ml.
      CAUTELA: La KOH deve essere maneggiata con DPI adeguati durante la regolazione del pH.
   3. Preparare i restanti 10 componenti della miscela master energetica alle concentrazioni indicate nella Tabella 1 in acqua deionizzata sterile e porre ciascuna pasta sul ghiaccio. Scongelare le scorte di ATP, GTP, CTP e UTP da 100 mM a RT e metterle in ghiaccio.
      NOTA: Se necessario, è possibile utilizzare un termomiscelatore impostato a 37 °C e 350 giri/min per sciogliere i reagenti nella soluzione. Non surriscaldare o lasciare reagenti sul termomiscelatore per un periodo di tempo prolungato.
   4. In una provetta da 15 mL, aggiungere ciascun componente della miscela master della soluzione energetica secondo l'ordine e il volume specificati nella Tabella 1. Agitare la soluzione dopo l'aggiunta di ogni componente. In questo modo si otterranno 5 ml di master mix di soluzione energetica 10x.
   5. Dividere la miscela master della soluzione energetica 10x in aliquote da 200 μl in provette da 2 mL. Congelare ogni aliquota. Metterli immediatamente nel congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso.
3. Master mix di aminoacidi
   1. Per preparare un master mix di aminoacidi 4x fresco, inizia scongelando ogni stock di aminoacidi a RT e poi mettendolo sul ghiaccio. Utilizzare un vortice e/o un termomiscelatore impostato a 37 °C e 350 giri/min per garantire che tutte le scorte di amminoacidi siano completamente disciolte.
      NOTA: La cisteina potrebbe non dissolversi completamente; Può essere aggiunto alla miscela master di aminoacidi come sospensione. Non surriscaldare o lasciare reagenti sul termomiscelatore per un periodo di tempo prolungato.
   2. In una provetta da 15 mL, aggiungere il volume appropriato di amminoacidi all'acqua deionizzata sterile in modo che la concentrazione finale di ciascuno sia di 8 mM nel seguente ordine: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU e CYS. Dopo aver aggiunto ogni amminoacido, agitare la soluzione della miscela master. I volumi elencati nella Tabella 1 costituiranno 2,4 mL di master mix di aminoacidi.
   3. Dividere la miscela master di 4 aminoacidi in aliquote da 200 μL in provette da 2 mL. Congelare ogni aliquota. Riporre immediatamente in congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso.
4. Produzione di un modello di DNA plasmidico pronto per la reazione
   NOTA: L'espressione delle proteine libere da cellule in questo sistema è stata ottimizzata utilizzando il vettore di espressione della proteina fluorescente verde (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Table of Materials). Si raccomanda di utilizzare questo plasmide come controllo dell'efficienza della reazione libera da cellule e della spina dorsale pJL1 per il clonaggio e l'espressione di altre sequenze proteiche. Possono essere utilizzati altri modelli di DNA plasmidico; tuttavia, è importante notare che la trascrizione è controllata da una sequenza del promotore T7 e dalla presenza di RNA polimerasi T7. Di seguito viene descritto un semplice protocollo per la produzione su larga scala di qualsiasi modello di DNA plasmidico da E. coli trasformato.
   1. Purificare il vettore desiderato utilizzando un kit di purificazione plasmidico secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). NOTA: Si raccomanda di concentrare il più possibile il modello di DNA plasmidico per soddisfare gli stretti vincoli di volume della reazione libera da cellule. In generale, puntare a uno stock di lavoro di 750-1500 ng/μL.

2. Esecuzione di reazioni di espressione proteica cell-free utilizzando l'estratto grezzo di V. natriegens

1. Espressione proteica libera da cellule utilizzando plasmidi o DNA modello lineare
   1. Togliere 10 aliquote di miscela master di soluzione energetica e 4 aliquote di miscela master di aminoacidi dal congelatore a -80 °C, scongelare a RT e mettere in ghiaccio. Estrarre le scorte di RNA polimerasi T7 e inibitore della RNasi dal congelatore a -20 °C e metterle sul ghiaccio. Scongelare il modello di DNA in RT e metterlo sul ghiaccio.
   2. Preparare una master mix di reazione priva di cellule come da Tabella 2 aggiungendo ciascun componente nel seguente ordine a una provetta da 2 ml su ghiaccio: master mix di aminoacidi, master mix di soluzioni energetiche, Mg-glutammato, K-glutammato, DNA stampo, PEG-8000, RNA polimerasi T7 e inibitore della RNasi. Muovi delicatamente il tubo dopo ogni aggiunta al mix master.
      NOTA: Se si vuole utilizzare un modello lineare per l'espressione di proteine libere da cellule, aggiungere 5-10 volte più materiale rispetto al modello plasmidico per ottenere rese apprezzabili di proteine.
   3. Rimuovere il lisato cellulare grezzo di V. natriegens dai congelatori a -80 °C e metterlo in ghiaccio per 10-20 minuti fino allo scongelamento. Aggiungere il volume appropriato di estratto di cellule grezze alla miscela master di reazione priva di cellule come indicato nella Tabella 2 e mescolare delicatamente muovendo o pipettando verso l'alto e verso il basso.
   4. Espressione di proteine libere da cellule terminali mediante un termociclatore
      1. Pipettare 10 μl della miscela master di reazione priva di cellule sul fondo di una piastra PCR a 96 o 384 pozzetti. Tra un trasferimento e l'altro sulla piastra PCR, miscelare la miscela master muovendo delicatamente la provetta.
         NOTA: La miscela master di reazione libera da cellule deve essere sempre ben miscelata per massimizzare la riproducibilità della reazione e l'espressione proteica libera da cellule in tutti i campioni.
   5. Centrifugare brevemente la piastra a 1.000 x g per 10 s per raccogliere l'eventuale miscela master che potrebbe essersi bloccata sui lati dei pozzetti. Sigillare i pozzetti con un adesivo per piastre per evitare l'evaporazione, quindi posizionare la piastra PCR in un termociclatore impostato a 26 °C con un coperchio riscaldato impostato a 105 °C.
      NOTA: La distribuzione uniforme del calore e il coperchio riscaldato di un termociclatore migliorano notevolmente la resa dell'espressione proteica.
   6. Incubare le reazioni libere da cellule per un minimo di 3 ore. Dopo l'incubazione, le proteine espresse possono essere purificate, quantificate e utilizzate per i processi a valle.
      NOTA: Le proteine espresse possono essere quantificate direttamente nella reazione cell-free utilizzando un metodo a scelta dell'utente. Ad esempio, le proteine fluorescenti possono essere quantificate utilizzando una curva standard esterna, oppure la radioattività può essere misurata se si utilizza un amminoacido radiomarcato nella reazione libera da cellule. La spettroscopia UV-visibile o i saggi delle proteine totali non sono generalmente raccomandati per misurare direttamente la produzione di proteine nelle reazioni prive di cellule senza una purificazione iniziale.

Tabella 1: Reagenti per la preparazione di 5 mL di 10x miscela madre di soluzione energetica e 2,4 mL di 4x miscela madre di amminoacidi.

Preparazione di 10x Energy Solution Master Mix
Componente	Concentrazione delle scorte (mM)	Concentrazione finale (mM)	Quantità (μL)	Volume finale (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
Programmazione	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA da E. coli MRE 600 (mg/mL)*	100	2	100.00
Coenzima A Idrato	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
accampamento	650	7.5	57.69
Acido folinico	100	0.7	35.00
Spermidina	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
Acqua deionizzata sterile			49.99
	Preparazione di 4x Amino Acid Master Mix
Componente	Concentrazione delle scorte (mM)	Concentrazione finale (mM)	Quantità (μL)	Volume finale (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARGOMENTO	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ASPIDE	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
SUO	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
INCONTRATO	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PRO	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
GIO	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Acqua deionizzata sterile			91.4

Tabella 2: Componenti della miscela master ottimizzata di reazione libera da cellule di V. natriegens per modello di DNA

Master Mix di reazione senza cellule
Componente	Concentrazione delle scorte (mM)	Concentrazione finale (mM)	Quantità (μL) 1x Reazione	Quantità (μL) 50x Reazioni
Estratto (%)		25	2.50	125.00
Mg-glutammato	100	3.5	0.35	17.50
K-glutammato	2000	80	0.40	20.00
4x Master Mix di aminoacidi	8.0	2	2.50	125.00
10x Soluzione energetica Master Mix			1.00	50.00
DNA plasmidico (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50% PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
T7 RNA polimerasi			1.00	50.00
Inibitore della RNasi, murino			0.10	5.00
Acqua deionizzata sterile			1.25	62.50
Volume di reazione (μL):	10

Materiali