Monitoraggio in tempo reale della crescita batterica mediante un sistema di coltura microfluidica a microgocce

Abstract

Fonte: Jian, X. et. al., Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura di microgocce microbiche (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra l'uso di una piattaforma basata su goccioline microfluidiche per il monitoraggio in tempo reale della crescita batterica. Generando goccioline uniformi contenenti sospensioni batteriche e guidandole attraverso un percorso di rilevamento, il sistema consente la misurazione ottica continua della densità cellulare per costruire una curva di crescita.

Protocollo

1. Preparativi

1. Collegare l'ago della siringa (il diametro interno è di 0,41 mm e il diametro esterno è di 0,71 mm), il connettore rapido A e il flacone del reagente (Figura 1C) e sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
   NOTA: Svitare leggermente il tappo del flacone del reagente durante la sterilizzazione. Ogni volta è possibile preparare alcuni flaconi di reagenti in più per l'uso.
2. Utilizzare un filtro al fluoruro di polivinilidene (PVDF) da 0,22 μm per filtrare l'olio del sistema di coltura a microgocce (MMC). Mettere in anticipo il chip microfluidico (Figura 1B) e l'olio MMC nel banco pulito e sterilizzarli mediante irradiazione ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.
   NOTA: Per i dettagli del connettore rapido A, del flacone del reagente, dell'olio MMC e del chip microfluidico, fare riferimento alla Tabella dei materiali.
3. Installare il chip microfluidico
   1. Aprire lo sportello della camera operativa (Figura 1A) e sollevare la sonda in fibra ottica.
   2. Allineare i fori del campo elettrico con gli aghi del campo elettrico e posizionare delicatamente il chip sul piedistallo del chip. Quindi inserire le due colonne di posizionamento nei fori di posizionamento e appoggiare la sonda in fibra ottica (Figura 1D).
   3. Collegare il connettore rapido A sul chip alla porta corrispondente della MMC in base al numero di posizione (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Quindi chiudere lo sportello della camera operativa.
4. Rabboccare l'olio MMC (a circa 80 ml) nel flacone dell'olio e svuotare il liquido di scarto nel flacone di scarto prima dell'uso.
   NOTA: Il liquido di scarto è solitamente costituito da rifiuti organici. Si prega di fare riferimento alla legge e al regolamento regionale al momento dello smaltimento, con riserva di modifiche in base all'impostazione sperimentale.

2. Misurazione della curva di crescita in MMC

1. Preparazione per la soluzione batterica iniziale
   1. Seguire le relative norme standard per preparare il terreno Luria-Bertani (LB) e l'autoclave a 121°C per 15 min.
      NOTA: Componenti del terreno LB: NaCl (10 g/L), estratto di lievito (5 g/L) e triptone (10 g/L).
   2. Estrarre il ceppo MG1655 di Escherichia coli (E. coli) dal ceppo di glicerolo e coltivarlo in un pallone da 50 mL con 10 mL di terreno LB in un incubatore ad agitazione (200 giri/min) a 37 °C per 5-8 ore.
      NOTA: Il tempo di coltivazione dipende dalle varietà specifiche. È ottimale coltivare il ceppo nel periodo/fase logaritmica.
   3. Diluire la soluzione di E. coli MG1655 in coltura con terreno fresco a una densità ottica a 600 nanometri (OD₆₀₀) di 0,05-0,1 per ottenere una soluzione batterica iniziale (preparare circa 10 mL).
2. Fare clic su Inizializzazione per inizializzare la MMC. Dopo che viene visualizzata l'interfaccia di inizializzazione, impostare la temperatura di coltivazione su 37 °C e il valore del segnale fotoelettrico su 0,6 (Figura 2A). L'inizializzazione richiederà circa 20 minuti.
3. Accendere la lampada a raggi ultravioletti (UV) (lunghezza d'onda 254 nm) durante l'inizializzazione.
4. Iniettare la soluzione batterica iniziale e l'olio MMC nel flacone del reagente.
   1. Estrarre un flacone di reagente sterilizzato sul banco pulito e serrare il tappo.
   2. Utilizzare una siringa sterile da 10 ml per iniettare 3-5 ml di olio MMC dall'ago della siringa del tubo laterale. Inclinare e ruotare lentamente il flacone del reagente per fare in modo che l'olio si infiltri completamente nella parete interna.
   3. Iniettare circa 5 ml di soluzione batterica iniziale, quindi riempire il flacone del reagente iniettando nuovamente 5-7 ml di olio.
   4. Estrarre il connettore rapido indipendente A e inserire il connettore rapido A del flacone del reagente nel connettore rapido B per completare l'operazione di iniezione del campione (Figura 3A).
5. Attendere il termine dell'inizializzazione e quindi spegnere la lampada UV (lunghezza d'onda 254 nm).
6. Aprire lo sportello della camera operatoria e inserire il flacone del reagente nel bagno di metallo.
7. Estrarre il connettore C2 del chip e il connettore rapido A del flacone del reagente. Collegare il connettore del tubo laterale del flacone del reagente al connettore C2 e il connettore del tubo superiore al connettore O2. Quindi chiudere lo sportello della camera operativa.
8. Fare clic su Curva di crescita per scegliere la funzione di misurazione della curva di crescita (Figura 2A). Nell'interfaccia di impostazione dei parametri, inserire il numero come 15, attivare l'interruttore di rilevamento OD e impostare la lunghezza d'onda su 600 nm. Fare clic su Avvia per avviare la generazione di droplet. Ci vorranno circa 10 minuti. NOTA: Qui, il numero si riferisce al numero di goccioline da generare. La lunghezza d'onda si riferisce alla lunghezza d'onda del diametro esterno da rilevare. Impostare il numero (massimo 200) e la lunghezza d'onda (350-800 nm) in base ai requisiti dell'esperimento.
9. Quando viene visualizzata una finestra pop-up sull'interfaccia principale che richiede "Rimuovere il flacone del reagente tra C2 e O2, quindi fare clic sul pulsante OK dopo il completamento", aprire lo sportello della camera operativa per estrarre il flacone del reagente e collegare i connettori C2 e O2.
10. Chiudere lo sportello e fare clic sul pulsante OK nella finestra pop-up per coltivare automaticamente le goccioline e rilevare i valori OD.
    NOTA: L'MMC rileva il valore OD quando la goccia passa la sonda in fibra ottica. Pertanto, il periodo di rilevamento dipende dal numero di goccioline generate.
11. Quando la curva di crescita raggiunge la fase stazionaria, fare clic sul pulsante Esportazione dati per esportare i dati OD. Selezionare il percorso di salvataggio dei dati ed esportare il valore OD registrato durante il periodo di coltivazione nel formato .csv, che può essere aperto da un software appropriato (ad es. Microsoft Excel). Quindi utilizzare un software di mappatura (ad esempio, EXCEL e Origin 9.0) per tracciare la curva di crescita.
    NOTA: Durante il processo di coltivazione, è possibile fare clic sull'esportazione dei dati in qualsiasi momento per esportare i dati OD di tutte le goccioline attuali.

Risultati

Figura 1: Struttura e strumenti essenziali della MMC. (A) Camera esterna e operativa di MMC. (B) Il chip microfluidico di MMC. Il chip ha sette canali (C1-C6 e CF). (C) Flacone di reagente. Ha un tubo orizzontale e un tubo laterale. Prima di iniettare il ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Membrana filtrante in PVDF da 0,22 μm	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilizzare l'olio MMC
Frigorifero a 4 °C	Haier	BCD-289BSW	Per la conservazione dei reagenti
Agar	Becton, Dickinson e compagnia	214010	Per la preparazione di piastre solide
Banco pulito	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Per funzionamento asettico e sterilizzazione UV
Computer	Lenovo	E450	Installazione software e controllo MMC
Incubatore a temperatura costante	Shanghai qixin strumento scientifico co., LTD	LRH 250	Per la coltivazione microbica con terreno solido
Bilancia elettronica	OHAUS	AR 3130	Per la pesata dei reagenti
Tubo EP	Thermo Fisher	1,5 ml	Per la raccolta delle goccioline
Tubo di congelamento	Thermo Fisher	2,0 ml	Per la conservazione delle deformazioni
Glicerolo	GENERALE-REAGENTE	G66258A	Per la conservazione delle deformazioni
Pentola di sterilizzazione a vapore ad alta pressione	SANYO Elettrico	MLS3020	Per sterilizzazione in autoclave
Sistema di coltura microbica a microgoccioline (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Esecuzione della determinazione della curva di crescita e dell'evoluzione adattiva. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Chip microfluidico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Per varie operazioni di droplet. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Olio MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La fase oleosa per la microfluidica delle goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	GENERALE-REAGENTE	G81793J	Componente del fluido LB
Petri	Corning Incorporated	90 millimetri	Per la preparazione di terreni solidi
Pipetta	Eppendorf	2,5 μl, 10 μl, 100μl, 1000μl	Per la manipolazione di liquidi
Raccordo rapido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Per il collegamento di ogni giunto. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Flacone di reagenti	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Campionamento e conservazione di soluzioni batteriche e reagenti. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Agitare il pallone	Unione-Biotecnologie	50 ml	Per la coltivazione microbica
Incubatore a scuotimento	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	CIELO-210 2B	Per la coltivazione microbica in pallone a shake
Siringa	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 ml	Aspirare il liquido e iniettarlo nel flacone del reagente
Ago per siringa	Ferramenta OUBEL	22 grammi	Il diametro interno è di 0,41 mm e il diametro esterno è di 0,71 mm.
Triptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Componente del fluido LB
Frigorifero a bassissima temperatura	SANYO Ultra-basso	in MDF-U4086S	Per la conservazione delle deformazioni (-80 °C)
Spettrofotometro UV-Vis	Azienda General Electric	Ultrospec 3100 pro	Per la misurazione dei valori OD
Estratto di lievito	Oxoid Ltd.	LP0021	Componente del fluido LB