Trasformazione naturale ed espressione della GFP nel cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

Abstract

Fonte: Weber, N., et al., Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video descrive una procedura per eseguire la trasformazione naturale in cianobatteri filamentosi utilizzando il DNA plasmidico per ottenere un'espressione stabile di GFP e resistenza agli antibiotici attraverso la ricombinazione omologa.

Protocollo

1. Trasformazione naturale ed espressione di GFP

NOTA: La trasformazione si basa su un vettore plasmidico propagato in Escherichia coli (E. coli); pGEM-T o pUC19 possono essere utilizzati come vettori dorsali. Esempi di vettori per l'espressione della proteina fluorescente verde supercartella (sfGFP) sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi.

1. Eseguire tutti i passaggi utilizzando materiale sterile in condizioni di laboratorio sterili (banco pulito, vetreria sterile).
2. Inoculare 2 x 50 mL di terreno liquido f/2 in due matracci da 250 mL con 2 x 1 mL di filamenti di Phormidium lacuna (P. lacuna) provenienti da una coltura in corso. Coltivare alla luce bianca (50 μmol ^{m-2 s-1}) sotto agitazione (rotazione orizzontale, 50 giri/min) per ~5 giorni a 25 °C.
3. Preparare ~200 μg del DNA del vettore di trasformazione utilizzando un kit di preparazione midi secondo le istruzioni del produttore.
4. Omogeneizzare 100 mL di sospensione cellulare di P. lacuna (vedere la Tabella dei materiali) a 10.000 giri/min per 3 minuti. Misurare il diametro esterno a 750 nm (valore desiderato = 0,35).
5. Centrifugare la sospensione cellulare per 15 minuti a 6.000 × g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 800 μl (volume totale compreso il liquido residuo e i filamenti) del liquido rimanente e del mezzo f/2⁺ aggiuntivo.
6. Prelevare otto piastre di bacto-agar f/2⁺ (diametro 10 cm) contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Pipettare 10 μg di DNA al centro di ciascuna piastra di agar. Pipettare immediatamente 100 μl di sospensione cellulare al centro di ciascuna piastra di agar (sopra il DNA).
7. Conservare la piastra di agar senza coperchio sul banco pulito per consentire l'evaporazione del liquido in eccesso. Chiudete il piatto e coltivatelo alla luce bianca a 25 °C per 2 giorni.
8. Distribuire i filamenti di ciascuna piastra di agar con un anello di inoculazione su diverse piastre di bacto-agar f/2⁺ fresche contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Coltivare le piastre alla luce bianca a 25 °C e controllare regolarmente le colture al microscopio.
9. Identificare i filamenti viventi trasformati dopo 7-28 giorni al microscopio. Cerca filamenti sani e verdi (Figura 1) che siano diversi dagli altri filamenti. Se questi filamenti verdi possono essere identificati, continuare con il passaggio successivo; In caso contrario, conservare la piastra per altri 7 giorni.
10. Utilizzare una pinza per trasferire questi filamenti viventi identificati in 50 mL di terreno liquido f/2⁺ con 250 μg/mL di kanamicina. Coltivare alla luce bianca a 25 °C su uno shaker (rotazione orizzontale, 50 giri/min). Osserva la crescita per un massimo di quattro settimane.
11. Trasferire nuovamente i filamenti in un terreno di agar contenente 250 μg/mL di kanamicina e attendere che i filamenti crescano. Dopo alcuni giorni, trasferire i singoli filamenti in una piastra di agar fresca con una concentrazione più elevata di kanamicina, ad esempio 500 μg/mL. Conservare la targa originale.
12. Assicurarsi che i filamenti siano propagati in un'alta concentrazione di kanamicina in coltura liquida o su agar. Aumentare nuovamente la concentrazione di kanamicina per accelerare la segregazione. NOTA: La P. lacuna trasformata cresce fino a 10.000 μg/mL di kanamicina. Altre specie potrebbero non tollerare concentrazioni così elevate.
13. Per l'espressione della GFP: osservare i singoli filamenti con un microscopio a fluorescenza ad un ingrandimento dell'obiettivo impostato a 40x o 63x. Cattura un'immagine di trasmissione in campo chiaro e un'immagine a fluorescenza. Utilizzare le seguenti impostazioni per la GFP: 470 nm passa-banda per l'eccitazione, 525 nm passa-banda per l'emissione e un divisore di fascio da 495 nm, tempo di esposizione iniziale di 500 ms.
14. Regolare il tempo di esposizione per ottenere chiari segnali di fluorescenza, evitando intensità di saturazione. Provare a utilizzare la stessa impostazione per tutti i campioni.
15. Poiché anche i filamenti wild-type mostreranno fluorescenza, acquisire immagini con le stesse impostazioni di cui sopra per questa fluorescenza di fondo.NOTA: Il ceppo che esprime GFP deve avere un segnale più alto; in caso contrario, non esprime GFP.
16. In base ai tempi di esposizione e all'intensità dei pixel delle immagini a fluorescenza, calcolare e confrontare il contenuto di GFP dei diversi filamenti.

Risultati

Figura 1. Filamenti di Phormidium lacuna 5 settimane dopo la trasformazione. È stato utilizzato il vettore di espressione sfGFP pMH1; la selezione è avvenuta su terreno f/2 con 120 μg/m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
Microscopio a fluorescenza ApoTome	Zeiss
Microscopio a fluorescenza Axio Imager 2	Zeiss
Kanamicina	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Microscopio DM750	Zeiss
Kit di estrazione plasmidico per la preparazione Midi NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Sorgente luminosa, tubo fluorescente L18W/954 luce diurna	OSRAM		Coltivazione di cianobatteri
Sorgente luminosa, pannello LED XL 6500K 140 W	Stella di fioritura	N/A	Coltivazione di cianobatteri
Piastre di Petri polistirolo, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Piastre di Petri polistirolo, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Pipetman 100-1.000 μl	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson	SKU: FA10004M
Pipette in plastica da 10 mL, sterili	Greiner	607107
Agitatore Unimax 2010	Strumenti Heidolph		Per la coltivazione
Provetta in plastica, sterile, 50 mL	Greiner	227261
Ultraturrax Frantoio Silenzioso M	Strumenti Heidolph		Omogeneizzatore
F/2+ mezzo liquido	f/2-medium, con NaNO₃ e NaH₂PO₄ 10 volte superiori (0,88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
F/2+-agar	3 % (p/v) bacto agar, acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi allo 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica allo 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄