Generazione di mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri tramite ricombinazione omologa

Abstract

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Generazione di mutanti marcati e privi di marcatori in specie cianobatteriche modello. J. Vis. Exp. (2016)

Il video mostra un metodo per generare mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri. Il protocollo inizia con la coltura dei cianobatteri, seguita dalle fasi di centrifugazione e lavaggio che preservano i pili superficiali. Viene quindi introdotto un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici affiancato da sequenze omologhe. Durante l'incubazione, il plasmide viene internalizzato tramite pili e sostituisce il gene bersaglio attraverso la ricombinazione omologa. La selezione e il riposo degli antibiotici vengono utilizzati per isolare e purificare il ceppo mutante.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura
   1. Preparare il terreno blu-verde 11 (BG11 medio) secondo Castenholz (1988).
      1. Preparare soluzioni madre di 100x BG11, oligoelementi e stock di ferro (Tabella 1).
      2. Preparare soluzioni separate di fosfato, carbonato di sodio (Na₂CO₃), tampone di acido N-[Tris(idrossimetil)metil]-2-amminoetanosolfonico (TES) e bicarbonato di sodio (NaHCO₃) (Tabella 1).
      3. Autoclavare in autoclave le scorte di fosfato e NaCO₃. Filtrare-sterilizzare il tampone TES e NaHCO₃ con filtri da 0,2 μm.
      4. Preparare BG11 combinando 976 ml di acqua, 10 ml di 100x BG11, 1 ml di oligoelementi e 1 ml di stock di ferro e sterilizzare in autoclave la soluzione. Dopo che questa soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 1 ml di brodo di fosfato, 1 ml di brodo di Na₂CO₃ e 10 ml di NaHCO₃.
      5. Per il terreno solido BG11, aggiungere 15 g di agar e 700 ml di acqua in un pallone. Al secondo pallone, aggiungere 3 g di tiosolfato di sodio (Na₂S₂O₃), 226 ml di acqua, 10 ml di 100x BG11, 1 ml di oligoelementi e 1 ml di brodo di ferro. Autoclave entrambe le soluzioni. Dopo che queste soluzioni si sono raffreddate a temperatura ambiente, combinarle e aggiungere 1 ml di brodo di fosfato, 1 ml di brodo di Na₂CO₃, 10 ml di tampone TES e 10 ml di NaHCO₃.
         NOTA: Le soluzioni vengono preparate separatamente per evitare la precipitazione di alcuni sali.
2. Per la selezione del saccarosio, preparare una soluzione di saccarosio al 50% (p/v). Filtrare: sterilizzare la soluzione con filtri da 0,2 μm e aggiungere a BG11 (100 ml di saccarosio al 50% a 900 ml di BG11) per produrre piastre di saccarosio BG11/5%.
   NOTA: Non aggiungere NaHCO₃ alle piastre di agar saccarosio BG11/5%. Aggiungere Na₂CO₃ come di consueto.
3. Per la coltura del Synechococcus, aggiungere 10 ml di acido 1 M 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico, N-(2-idrossietil)piperazina-N'-(acido 2-etansolfonico) (HEPES) e 1 ml di vitamina B12 (Tabella 1) a 1 L di terreno BG11.
   NOTA: La trasformazione dei ceppi coltivati in terreni BG11 disponibili in commercio è significativamente meno efficiente rispetto alle ricette di terreni BG11 qui descritte e, pertanto, non è raccomandata.

Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo studio.

Ricette di soluzioni di brodo
Chimico	Quantità (g)
100x BG11 (per L)
NaNO₃	149.6
MgSO₄·7H₂O	7.49
CaCl₂·2H₂O	3.6
Acido citrico	0.6
Aggiungere 1,12 ml di Na₂EDTA 0,25 M, pH 8,0
0,25 M Na₂EDTA, pH 8,0 (per 100 ml)
Na₂EDTA	9.3
Oligoelementi (per 100 ml)
H₃BO₃	0.286
MnCl₂·4H₂O	0.181
ZnSO₄·7H₂O	0.022
Na₂MoO₄·2H₂O	0.039
CuSO₄·5H₂O	0.008
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.005
Brodo di ferro (per 100 ml)
Citrato ferrico di ammonio	1.11
Brodo di fosfati (per 100 ml)
K₂HPO₄	3.05
Na2CO3 (per 100 ml)
Na₂CO₃	2
Tampone TES, pH 8,2 (per 100 ml)
TES	22.9
Brodo NaHCO3 (per 100 ml)
NaHCO₃	8.4
HEPES, pH 8,2 (per 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamina B₁₂ (Per 50 ml)
Cianocobalamina	0.02
Luria Bertani media (Per 500 ml)
Brodo Luria Bertani	12.5
1 M di MgCl₂ (per 100 ml)
MgCl₂·6H₂O	20.33
Soluzione A (per 200 ml)
MnCl₂·4H₂O	0.395
CaCl₂·2H₂O	1.47
Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico idrato, Acido 4-Morfolinotetansolfonico (MES)	0.4265
Soluzione A + glicerolo
10 ml di soluzione A
1,5 ml di glicerolo

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Crescita di ceppi cianobatterici

1. Filtrare in matracci conici da 100 ml con un volume massimo di 50 ml e agitare a 120 giri al minuto (rpm). Sigillare le piastre BG11 con Parafilm e praticare tre piccoli fori sul lato della piastra per consentire lo scambio di gas. Incubare tutti i ceppi a 30 °C sotto lampadine fluorescenti in un fotobioreattore a un'intensità luminosa compresa tra 20-40 μmol di fotoni m-2 sec-1.
2. Utilizzare le migliori tecniche sterili. Gestire tutti i ceppi cianobatterici in una cappa a flusso laminare.
   NOTA: Ciò è particolarmente importante quando i ceppi vengono coltivati con terreni contenenti saccarosio, che possono essere facilmente contaminati.

3. Generazione di costrutti plasmidici

1. Progettazione di set di primer, inclusi i siti enzimatici di restrizione richiesti, utilizzando software di progettazione di primer come Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), per amplificare due regioni 5' e 3' di ~1 kb del gene di interesse. Consultare la sequenza del genoma della specie cianobatterica tramite Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). Vedere la Tabella 2 per tutti i primer utilizzati qui. Quando si progettano i primer, considerare i seguenti fattori:
   1. Assicurarsi che le regioni amplificate includano le regioni 5' e 3' del gene che verrà mutato, ad es. Figura 1.
   2. Non mutare le regioni intergeniche per evitare mutazioni involontarie di RNA antisenso e non codificanti.
   3. Quando si scelgono le regioni fiancheggianti, non includere l'intero frame di lettura aperto dei geni adiacenti, poiché l'espressione di questi geni in Escherichia coli può interferire con la clonazione.
2. Amplifica i prodotti mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando DNA polimerasi ad alta fedeltà secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Nella nostra esperienza, questo enzima produce pochi errori.
   1. Impostare reazioni PCR da 50 μl contenenti tampone ad alta fedeltà (tampone HF) e 0, 1,5 o 3 μl di dimetilsolfossido (DMSO). Utilizzare 100 ng di DNA genomico per reazione. Utilizzare un programma composto da una fase iniziale di denaturazione di 98 °C per 30 secondi, 35 cicli di 98 °C per 10 secondi, 67 °C per 30 secondi, 72 °C per 30 secondi, seguiti da una fase di estensione finale di 72 °C per 5 minuti. Questo in genere fornisce prodotti coerenti.
3. Verificare i prodotti PCR e i campioni digeriti con enzimi endonucleasi per verificarne la dimensione corretta tramite elettroforesi su gel. Eseguire gel di agarosio all'1% (p/v) contenenti lo 0,02% (v/v) di bromuro di etidio per 45 minuti a 100 V.ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un potenziale mutageno e deve essere maneggiato con una protezione adeguata.
4. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Inoltre, utilizzare questo kit per la purificazione di frammenti di plasmidi, compresi i pezzi tagliati da gel di agarosio. Eluire il DNA purificato in 14 μl di acqua.
5. Per le fasi di clonazione, incubare le miscele di reazione endonucleasica di restrizione a 37 °C per >1 ore in un volume totale di 30 μl secondo le istruzioni del produttore.
6. Per le fasi di legatura, legare frammenti di DNA a temperatura ambiente per >1 ora in un volume totale di 20 μl, contenenti 5 μl di plasmide digerito purificato, 12 μl di inserto digerito purificato, 2 μl di tampone e 1 μl di ligasi.
7. Preparare le cellule trasformanti DH5α di Escherichia coli secondo il seguente metodo.
   1. Coltiva una coltura notturna di E. coli in terreni di coltura Luria Bertani (LB) da 10 ml.
   2. Inoculare 400 ml di LB in un pallone conico da 1 L contenente 6 ml di 1 M di MgCl₂ (Tabella 1) con 1 ml di coltura notturna.
   3. Far crescere la coltura a 37 °C a 220 giri/min per circa 4 ore o fino a quando OD₆₀₀nm raggiunge 0,4-0,6.
   4. Mettere le cellule sul ghiaccio per 1 ora.
   5. Centrifugare a 2.800 × g per 10 minuti fino a pellettare le celle a 4 °C.
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere in 160 ml di soluzione A (Tabella 1) e incubare su ghiaccio per 20 minuti.
   7. Centrifugare a 2.800 × g per 10 minuti fino a pellettare le celle a 4 °C.
   8. Rimuovere il surnatante e risospendere in 4 ml di soluzione A + glicerolo (Tabella 1).
   9. Preparare aliquote da 50 μl, congelare nel liquido N2 e conservare a -80 °C.
   10. Mescolare 5 μl di miscela di legatura con 50 μl di cellule competenti e incubare per 1 ora su ghiaccio.
   11. Shock termico delle celle a 42 °C per 90 sec, quindi incubazione su ghiaccio per 2 min.
   12. Aggiungere 950 μl di terreno LB (Tabella 1) e incubare a 37 °C per 1 ora.
   13. Aliquotare 50 e 200 μl su piastre con l'antibiotico appropriato, ampicillina (100 μg/ml) e/o kanamicina (30 μg/ml).
       CAUTELA: Sia la kanamicina che l'ampicillina sono tossiche e devono essere maneggiate con una protezione adeguata.
   14. Prelevare e incubare singole colonie in 2 ml di terreno LB inoculato con l'antibiotico appropriato.
8. Purificare tutti i plasmidi utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi miniprep secondo le istruzioni del produttore.
9. Generare plasmidi, in questo esempio specifico per eliminare i geni cpcC1C2 , secondo i seguenti passaggi.
   1. Amplificare le 1.012 coppie di basi (bp) 5' della regione fiancheggiante (frammento sinistro) utilizzando i primer cpcC1C2leftfor e cpcC1C2leftrev (vedere il passaggio 3.2, Tabella 2). Rimuovere una piccola quantità della reazione PCR e confermare se il prodotto della dimensione corretta è stato amplificato tramite elettroforesi su gel (passaggio 3.3). Digerire questo frammento e pUC19 con XbaI e BamHI (passaggio 3.5).
   2. Purificare entrambe le preparazioni (fase 3.4), legare (fase 3.6), trasformare (fase 3.7) e impostare quattro colture liquide da 2 ml di libbra con ampicillina (100 μg/ml) da colonie separate per la purificazione dei plasmidi tramite miniprep (fase 3.8).
   3. Verificare l'inserimento del frammento in pUC19 tramite digestione XbaI/BamHI ed elettroforesi su gel (passaggio 3.3). Bande di 2.660 bp e 1.012 bp indicano la corretta introduzione dell'inserto nel plasmide.
   4. Amplificare la regione fiancheggiante di 1.016 bp 3' (frammento destro) utilizzando i primer cpcC1C2rightfor e cpcC1C2rightrev (vedere il passaggio 3.2, Tabella 2). Rimuovere una piccola quantità della reazione PCR e confermare se il prodotto della dimensione corretta è stato amplificato tramite elettroforesi su gel (passaggio 3.3). Digerire questo frammento e pUC19 con SacI ed EcoRI (passaggio 3.5).
   5. Purificare entrambe le preparazioni (fase 3.4), legare (fase 3.6), trasformare (fase 3.7) e impostare quattro colture liquide da 2 ml di libbra con ampicillina (100 μg/ml) da colonie separate per la purificazione dei plasmidi tramite miniprep (fase 3.8).
   6. Verificare l'inserimento del frammento in pUC19 tramite digestione SacI/EcoRI (fase 3.5) ed elettroforesi su gel (fase 3.3). Bande di 2.660 bp e 1.016 bp indicano la corretta introduzione dell'inserto nel plasmide. NOTA: Ove possibile, vengono utilizzati i siti XbaI/BamHI per la clonazione della regione 5' e SacI/EcoRI per la clonazione della regione 3' in pUC19. Se possibile, includere sempre un sito BamHI sul primer inverso per la regione 5' o sul primer in avanti per la regione 3' per garantire che le fasi successive di clonazione siano più facili da eseguire.
   7. Sequenziare entrambi gli inserti per determinare se la sequenza è corretta utilizzando primer che coprono il sito di inserimento , ad esempio M13 in avanti e M13 in avanti (Tabella 2). La sequenza deve essere corretta per garantire che non vengano introdotti errori nelle regioni di fiancheggiamento.
   8. Asportare il frammento sinistro da pUC19 tramite digestione XbaI/BamHI. Digerire il frammento pUC19 + destro con XbaI/BamHI (passaggio 3.5).
   9. Purificare il frammento sinistro da 1.012 bp e il frammento pUC19 + destro da 3.676 bp da un gel di agarosio (passaggio 3.3) mediante escissione del DNA utilizzando una lama di bisturi.
   10. Purificare entrambe le preparazioni (fase 3.4), legare (fase 3.6), trasformare (fase 3.7) e impostare quattro colture liquide da 2 ml di LB con ampicillina (100 μg/ml) da colonie separate per la purificazione dei plasmidi tramite miniprep (fase 3.8).
   11. Verificare l'inserimento del frammento in pUC19 + frammento destro tramite digestione XbaI/BamHI (passaggio 3.5) ed elettroforesi su gel (passaggio 3.3). Bande di 3.676 bp e 1.012 bp indicano il corretto inserimento dell'inserto nel plasmide (a questo si fa riferimento come plasmide B).
   12. Asportare la cassetta della neomicina fosfotransferasi/levansucrasi (npt1/sacB) da pUM24cm19 tramite digestione BamHI. Digerire il plasmide B con BamHI (passaggio 3.5).
       NOTA: La cassetta npt1/sacB non deve essere purificata da gel di agarosio poiché pUM24cm codifica una proteina che conferisce resistenza al cloramfenicolo. Pertanto, se le colonie vengono coltivate su piastre di agar LB/ampicillina/kanamicina, l'unica combinazione possibile che porterà a colonie resistenti è l'incorporazione della cassetta npt1/sacB nel plasmide B.
   13. Purificare entrambe le preparazioni (fase 3.4), legare (fase 3.6), trasformare (fase 3.7) e impostare quattro colture liquide da 2 ml di LB con ampicillina (100 μg/ml) e kanamicina (30 μg/ml) da colonie separate per la purificazione dei plasmidi tramite minipreps (fase 3.8).
   14. Verificare l'inserimento della cassetta npt1/sacB nel plasmidico B tramite digestione BamHI (fase 3.5) ed elettroforesi su gel (fase 3.3). Bande di 4.688 bp e 3.894 bp indicano il corretto inserimento dell'inserto nel plasmide (a questo si fa riferimento a questo come plasmide A).

Tabella 2: Primer utilizzati in questo studio. Vengono sottolineati i siti di restrizione delle endonucleasi.

Abbecedario	Sequenza
cpcC1C2leftfor	GTACTCTAGAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev	GATCGGATCCGCGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2rightfor	GATCGAGCTGCACTGGTCAGTCGTTC
cpcC1C2rightrev	GACTGAATTCATCGTTGCTTGAACGGTCTC
M13 in avanti	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 retromarcia	CAGGAAACAGCTATGAC
cpcC1C2per	GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev	ATGTCCCAGGAACGACTGAC
A1173per	AGCAAACCGTTTTTGTGACC
A1173rev	TGCAAGGTGGCGAACTGTAT

 

 

4. Generazione di mutanti marcati di Synechocystis e Synechococcus

1. Impostare una coltura fresca inoculando un anello pieno di cellule in 30-50 ml di terreno BG11. Coltiva la coltura per 2-3 giorni fino a una densità ottica di 750 nanometri, o OD₇₅₀nm = da 0,2 a 0,6.
   NOTA: In genere, le singole colonie sono troppo piccole per essere utilizzate per l'inoculazione e l'esposizione delle singole cellule anche a bassi livelli di luce comporterà la fotoinibizione e la selezione per mutanti resistenti alla luce.
2. Centrifugare 1-2 ml di coltura a 2.300 × g per 5 minuti e scartare il surnatante. Non centrifugare colture cianobatteriche a >2.300 × g, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule. Lavare il pellet una volta con il mezzo BG11.
   NOTA: Non risospendere le cellule con il vortex, poiché ciò potrebbe causare la perdita di pili, che sono essenziali per l'assorbimento del DNA. Risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato.
3. Aggiungere il terreno BG11 fino a un volume finale di 100 μl. Trasferire le cellule in una provetta a fondo tondo da 14 ml.
4. Aggiungere 1 μg di plasmide A alle cellule e mescolare picchiettando delicatamente. Aggiungere <10 μl di plasmide.
   NOTA: Preferibilmente, il plasmide dovrebbe essere a una concentrazione di >100 ng/μl, ma concentrazioni inferiori a questa sono adeguate per una trasformazione di successo.
5. Appoggiare i tubi orizzontalmente nell'incubatrice. Incubare le colture per 4-6 ore.
   NOTA: Le celle possono essere mescolate brevemente toccando ogni 1-2 ore, ma questo non è essenziale. I campioni possono essere collocati in un incubatore a scuotimento, anche se ciò non migliora significativamente l'efficienza.
6. Spargere aliquote della miscela di coltura cellulare/DNA plasmidico su piastre di agar BG11 senza antibiotici. Tipicamente, aliquote da 20 μl e 80 μl sono distribuite su piastre separate.
7. ~24 ore dopo, aggiungere 2,5-3 ml di una soluzione di agar allo 0,6% in acqua contenente kanamicina (per 20 ml: 0,12 g di agar, 100 μl di 100 mg/ml di kanamicina) alla piastra di agar. Raffreddare questa soluzione a ~42 °C e aggiungerla al bordo della piastra di agar. Inclinare la piastra in modo che la soluzione formi uno strato uniforme di "agar superiore" sulla superficie.
8. Incubare le piastre di agar per un ulteriore periodo di tempo. Le colonie dovrebbero essere visibili dopo circa 7 giorni.
   NOTA: Le piastre di agar possono essere impilate a 3 in un'incubatrice. In genere, si ottengono centinaia di colonie per trasformazione.
9. Striare singole colonie su piastre di agar BG11 + kanamicina (30 μg/ml). Dividi la piastra di agar in 6 settori e usa uno stuzzicadenti smussato per striare le colonie su ogni settore. Ottenere singole colonie non è importante; solo la crescita dei trasformanti lo è.

Risultati

Figura 1: Costruzione di plasmidi per la generazione di knockout marcati e non marcati, ad esempio cpcC1 e cpcC2 in

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	Visualizzazione del materiale C1016
Acido citrico	Sigma	Codice: C0759
Na₂EDTA	Pescatore	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	Codice: M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrato ferrico di ammonio	Sigma	F5879
K₂HPO₄	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pescatore	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pescatore	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cianocobalamina	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Saccarosio	Pescatore	SUC001
Piastra Petri 90 mm a triplo sfiato	Greiner	633185
Filtri da 0,2 μm	Sartorius	16534
Palloni conici da 100 ml	Pirex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Fusione	F-530
Agarosio	Melford	MB1200
Kit di purificazione del DNA	MoBio	12100-300
Endonucleasi di restrizione	NEB
T4 ligasi	Termo Scientifico	EL0011
Brodo Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	Visualizzazione del materiale M8250
Kanamicina solfato	Sigma	60615
Ampicillina	Sigma	Codice: A9518
Kit di miniprep per plasmidi GeneJET	Termo Scientifico	K0503
Tubo a fondo tondo da 14 ml	Falco BD	352059
Glicerolo	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418