Generazione di mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri tramite ricombinazione omologa

Abstract

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Generazione di mutanti marcati e privi di marcatori in specie cianobatteriche modello. J. Vis. Exp. (2016)

Il video mostra un metodo per generare mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri. Il protocollo inizia con la coltura dei cianobatteri, seguita dalle fasi di centrifugazione e lavaggio che preservano i pili superficiali. Viene quindi introdotto un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici affiancato da sequenze omologhe. Durante l'incubazione, il plasmide viene internalizzato tramite pili e sostituisce il gene bersaglio attraverso la ricombinazione omologa. La selezione e il riposo degli antibiotici vengono utilizzati per isolare e purificare il ceppo mutante.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura
   1. Preparare il terreno blu-verde 11 (BG11 medio) secondo Castenholz (1988).
      1. Preparare soluzioni madre di 100x BG11, oligoelementi e stock di ferro (Tabella 1).
      2. Preparare soluzioni separate di fosfato, carbonato di sodio (Na₂CO₃), tampone di acido N-[Tris(idrossimetil)metil]-2-amminoetanosolfonico (TES) e bicarbonato di sodio (NaHCO₃) (Tabella 1).
      3. Autoclavare in autoclave le scorte di fosfato e NaCO₃. Filtrare-sterilizzare il tampone TES e NaHCO₃ con filtri da 0,2 μm.
      4. Preparare BG11 combinando 976 ml di acqua....

Risultati

Figura 1: Costruzione di plasmidi per la generazione di knockout marcati e non marcati, ad esempio cpcC1 e cpcC2 in

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	Visualizzazione del materiale C1016
Acido citrico	Sigma	Codice: C0759
Na₂EDTA	Pescatore	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	Codice: M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrato ferrico di ammonio	Sigma	F5879
K₂HPO₄	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pescatore	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pescatore	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cianocobalamina	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Saccarosio	Pescatore	SUC001
Piastra Petri 90 mm a triplo sfiato	Greiner	633185
Filtri da 0,2 μm	Sartorius	16534
Palloni conici da 100 ml	Pirex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Fusione	F-530
Agarosio	Melford	MB1200
Kit di purificazione del DNA	MoBio	12100-300
Endonucleasi di restrizione	NEB
T4 ligasi	Termo Scientifico	EL0011
Brodo Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	Visualizzazione del materiale M8250
Kanamicina solfato	Sigma	60615
Ampicillina	Sigma	Codice: A9518
Kit di miniprep per plasmidi GeneJET	Termo Scientifico	K0503
Tubo a fondo tondo da 14 ml	Falco BD	352059
Glicerolo	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418