Generazione di pellicole batteriche nanocellulose incorporate nella magnetite

Abstract

Fonte: Arias, S. L., et al. Fabbricazione di una nanocellulosa batterica magnetica funzionalizzata con nanoparticelle di ossido di ferro. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra la sintesi in situ di nanoparticelle di magnetite all'interno di una pellicola batterica di nanocellulosa prodotta da Gluconacetobacter xylinus. Spiega come la nanocellulosa batterica magnetica venga generata tramite infusione di ioni ferro, precipitazione alcalina e purificazione.

Protocollo

1. Sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro rivestite in polimero e la loro deposizione in una membrana di nanocellulosa batterica (BNC)

1. Far bollire 1.000 ml di acqua ad alta purezza con gas azoto per rimuovere l'ossigeno disciolto nell'acqua e sostituirlo con azoto.
2. Utilizzare una fiaschetta a fondo tondo a tre colli per preparare una soluzione in rapporto molare 2:1 di cloruro di ferro (III) esaidrato (FeCl_{3,6H 2}O) e cloruro di ferro (II) tetraidrato (FeCl 2,4H ₂O) diluiti con acqua ad alta purezza deossigenata. Ad esempio, si utilizzano 5,4 g di FeCl_{3,6H 2}O e 1,98 g di FeCl 2,4H₂O in 10 ml di acqua ad alta purezza deossigenata. Se questa preparazione diventa troppo viscosa e difficile da mescolare, si utilizzano 0,54 g di FeCl_{3,6H 2}O e 0,198 g di FeCl_{2,4H 2}O in 20 ml di acqua ad alta purezza deossigenata.
   NOTA: Riduci il tempo di esposizione del FeCl_{2.4H 2}O all'aria pesando questo composto chimico il più rapidamente possibile. Una volta introdotta nella fiaschetta a fondo rotondo a tre colli, chiudere la fiaschetta a fondo rotondo a tre colli con tappi di settio finché non è collegata all'alimentazione del gas azoto e al tubo del condensatore.
3. Utilizzare due colli del contenitore per garantire un ingresso e un'uscita costanti di gas azotato collegando l'alimentazione del gas azotato a un ago infilato in un tappo del setto e fissato al collo del recipiente.
4. Inserire 1 pellicola BNC (15,6 mm di diametro e 2-3 mm di spessore) nel recipiente con i reagenti. Assicurati che il campione sia completamente immerso nel liquido.
5. Collega il collo rimanente del recipiente a un tubo del condensatore. Inoltre, utilizza un tubo di essiccazione riempito di solfato di calcio anidro sopra il tubo del condensatore. Fai passare l'acqua attraverso il tubo del condensatore.
6. Sigilla tutte le giunzioni di vetro con grasso sottovuoto.
7. Riscalda la soluzione in un bagno d'olio di silicone a 80 °C usando una piastra riscaldante e mantieni questa temperatura fino al passo 1.10. Usa una piccola barra magnetica per mescolare i reagenti a 350 giri/min per 5 minuti. Assicurati che il BNC sia adeguatamente impregnato con la soluzione ferrosa e che i reagenti siano completamente disciolti. Continua a mescolare la miscela fino alla fine dell'esperimento.
   NOTA: Usa un termometro per verificare la temperatura dell'olio di silicone. Dovrebbe essere stabile fino a 80 °C.
8. Aumentare la velocità di mescolazione a 700 giri/min e aggiungere (abbassando), in un intervallo di 5 minuti, 5 ml di idrossido di ammonio (NH₄OH, 14%) ai 10 ml di soluzione ferrosa usando un ago per pipettaggio, che è stato anch'esso infilato in un tappo del setto. Dopo l'aggiunta dell'idrossido di ammonio, il colore della soluzione cambia da giallo/arancione a nero.
9. Continua a mescolare la soluzione a 80 °C per altri 5 minuti. Evitare le agitazioni ad alta velocità per mantenere l'integrità del campione. Alte velocità, cioè superiori a 1.000 giri/min, possono distruggere il campione.
10. Abbassa la temperatura della soluzione a 30 °C usando il fondo della piastra riscaldante e continua a mescolare per altri 5 minuti. Poi, spegni la piastra riscaldante. A questo punto, le nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) sono state incorporate nella rete BNC.
11. Raffreddare la miscela fino alla temperatura ambiente (RT) e separare le nanoparticelle magnetiche (MNP) e il BNC usando un potente magnete permanente (ad esempio, 1 Tesla). Per farlo, trasferire la miscela su una fiaschetta del recipiente e poi, mantenendo il magnete vicino al recipiente, tenere in posizione i MNP e il BNC mentre si decanta il surnatante.
    Nota: Fai attenzione quando maneggi magneti forti perché possono essere dannosi se usati in modo errato. Per i passaggi (1.12) - (1.14) e (1.16) si utilizza l'acqua ad alta purezza deossigenata preparata in precedenza in (1.1) per prevenire l'ossidazione delle particelle.
12. Sospezione riportata i MNP e il BNC in 100 ml d'acqua. Scuoti delicatamente la soluzione per rimuovere tutte le MNP che non sono fortemente incorporate nel BNC. Fai di nuovo la decantazione del sovrandanante tenendo in posizione le MNP e il BNC usando il magnete.
13. Lavare le MNP e il BNC più volte con acqua finché il sovrantantante non raggiunge un pH neutro (pH~7), misurato con una striscia colorimetrica.
14. Separare il BNC funzionalizzato magneticamente o nanocellulosa batterica magnetica (MBNC) dalle MNP usando una pinzetta e sciacquare il MBNC più volte con acqua finché l'acqua non diventa limpida.
15. Sterilizza l'MBNC esponendo il O/N del MBNC ai raggi UV (110-280 nm).
16. Autoclave 500 ml di acqua alta purezza deossigenata a 120 °C per 20 minuti e conservare l'MBNC in 20 ml di quest'acqua.
17. Asepticamente, immergi il campione nell'1% di polietilenglicole (PEG) e mescolare per 2 ore a RT (37 °C). Questa procedura migliora la biocompatibilità e la stabilità delle nanoparticelle di ossido di ferro depositate nel BNC, in particolare quelle esposte in superficie. Il rivestimento PEG sarà distribuito sulla rete MBNC 3D.
    NOTA: Gli IONP nudi si ossidano facilmente nell'aria grazie alla loro elevata attività chimica. Anche se il PEG è considerato un materiale non biodegradabile, la sua stabilità chimica dipende dalle condizioni biologiche applicate come il contenuto d'acqua, il pH, la temperatura, la presenza di enzimi, specie reattive di ossigeno, specie reattive di azoto e altre.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Cloruro di Ferro(III) Esaidrato	Sigma Aldrich	236489-100G
Idrossido di ammonio	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poli (glicole etilenico), media Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Cloruro di ferro (II) tetraidrato	Sigma Aldrich	44939-250G
Solfato di calcio anidro	W.A. Hammond Drierite	13001
Grasso ad alto vuoto	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Strisce di test per il pH	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Fiaschetta per distillazione a tre angoli con fondo rotondo	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Olio di silicone per bagni d'olio	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Tubo di essiccazione	Chemglass	CG-1295-01
Tappo del setto, tipo di manicotta	Chemglass	CG-3022-98
Barra di agitazione magnetica	Chemglass	CG-2001-05
Condensatore	Chemglass	CG-1218-01
Controllore di temperatura	BriskHeat	SDC120JC-A
Piastra riscaldante a mescolare	Fisher Scientific	11-100-49SH