Test fluorescente ad alta produttività per studiare le interazioni microbio-vermi

Abstract

Fonte: Ali, I., et al. Screening ad alto rendimento di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2022)

Questo video mostra un saggio fluorescente ad alta produttività per valutare come i batteri intestinali influenzino la resilienza allo stress in Caenorhabditis elegans. Tracciando la fluorescenza blu dei granuli intestinali rotti, il test rivela segnali di morte precedenti nei vermi esposti ai batteri testati.

Protocol

1. Impostazione senza etichetta per Caenorhabditis elegans (C. elegans), valutazione per la sopravvivenza (LFASS), shock termico e test ossidativo (Giorni 13 - 14)

1. Valuta lo stadio di sviluppo dei vermi. Una volta che il >90% dei vermi ha raggiunto L4, raccogliere i vermi in fino a 10 mL di soluzione sterile di M9 in tubi conici da 15 mL.
2. Lava i vermi a fondo (almeno 4 volte) centrifugandoli a 142xg per 2 minuti a 4 °C, rimuovendo il soprantantante e aggiungendo 10 mL di M9 sterile fresco tra ogni lavaggio e l'altro per eliminare i batteri Escherichia coli OP50. Risospendere il pellet di vermi in 10 mL di M9.
3. Trasferire 50 μL di soluzione di verminiforme in un tubo di legame a bassa superficie contenente 950 μL di M9. Dopo aver miscelato delicatamente il contenuto del tubo per evitare la sedimentazione di vermi, si utilizza rapidamente una punta di pipetta a basso legame bagnata per trasferire 3-4 gocce separate da 10 μL su una vetrata di vetro o su una piastra di mezzo di crescita a nematodi (NGM). Contare i numeri dei vermi sotto uno stereomicroscopio a un ingrandimento 16x. Fai la media dei conteggi delle 3-4 gocce e determina il numero di vermi per microlitro nella soluzione del verme.
4. Regolare la concentrazione di vermi nel tubo da 10 mL per raggiungere ~120 vermi in 8 μL. Se la soluzione è stata preparata nello Passo 1.2. non è abbastanza concentrato, si fa girare i vermi verso il basso e si rimuove M9 di conseguenza per raggiungere 120 vermi per 8 μL.
5. Trasferire 8 μL di soluzione di vermi (~120 vermi) in ciascuno dei pozzi delle otto lastre NGM-agarosio da 96 pozzi preparate in precedenza, utilizzando una pipetta multicanale o una pipetta ripetuta. Assicurati di usare puntini a bassa ritenzione per limitare la perdita di vermi. Potrebbe anche essere necessario tagliare le estremità delle punte per permettere l'uso di grandi vermi adulti e limitare lo stress meccanico sugli adulti.
   NOTA: Il test richiede almeno 30 vermi vivi sani per funzionare in modo affidabile, ma funziona meglio con circa 100 vermi per pozzo.
6. Incubare le piastre NGM-agarosio a 96 pozzi seminate da vermi e batteri a 25 °C per 36 ore.
7. Controlla le placche tra 12 e 24 ore, assicurandoti che i vermi rimangano pieni per tutto il tempo. Se è necessario rinutrirsi, risospendere i batteri all'interno della piastra batterica a 96 pozzi conservata a 15 °C, e aggiungere fino a 10 μL della corrispondente soluzione batterica alle placche NGM-agarosio a 96 pozzi dove i vermi sono a rischio di fame prima della fine del periodo di incubazione di 36 ore (i vermi affamati produrranno risultati molto diversi, Quindi questo è molto importante).
   NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti al giorno 15. Prima di iniziare il saggio, potrebbe essere necessario ottimizzare l'altezza di lettura. La lettura ottimale sarà raggiunta 20-50 μm sopra il fondo del pozzo. Questo dipenderà dal modello del lettore di placche. Alcuni offrono la possibilità di una scansione Z, mentre altri consentono l'inserimento manuale dell'altezza. Imposta l'altezza ottimale al livello in cui viene rilevato il segnale di fluorescenza blu più alto (365 nm/430 nm). Alcuni lettori di lastre possono operare a un'altezza fissa ottimizzata per i saghi a celle aderenti e potrebbero non essere ideali per i sei LFASS.
8. Dopo 36 ore, eroga 30 μL di M9 in ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi.
   NOTA: Per i saggi di stress termico, il lettore di lastre deve aver raggiunto la temperatura richiesta per eseguire il test e potrebbe dover essere attivato in anticipo. L'attuale protocollo utilizza 42 °C per massimizzare la velocità di uccisione, ma l'approccio si applica ad altre temperature superiori a 30 °C.
9. Trasferire i vermi (circa 20 μL) sulla piastra a 384 pozzi secondo i layout del set, utilizzando punte a bassa ritenzione (considera di tagliare l'estremità delle punte per permettere ai vermi grandi di ridurre lo stress meccanico per i vermi adulti).
   NOTA: Per il presente studio, per i due saghi descritti qui (stress termico e stress ossidativo) vengono utilizzate due diverse impostazioni del lettore di lastre (stress termico e stress ossidativo), e quindi, i campioni destinati a questi due sami non devono essere placcati nella stessa piastra a 384 pozzi.
10. Assicurati che i lettori di lastre siano posizionati correttamente (Tabella 1).
11. Riempire le piastre da 384 pozzi con più M9, puntando a un volume finale di 60 μL per pozzo. Per il test di stress termico, aggiungere 40 μL di M9, e per lo stress ossidativo indotto da tert-butyl hydroperoxid (t-BHP), aggiungere 34 μL di M9 in 6 μl di t-BHP.
    1. Inizia il test entro 2 minuti dall'aggiunta di t-BHP (idealmente, tutti i vermi devono essere esposti simultaneamente a t-BHP, con risoluzione in tempo di prova di 2 minuti). Se non è possibile, si usa un timer per stimare il tempo impiegato a pipetare t-BHP prima dell'inizio del saggio, così da consentire una successiva modifica del tempo mediano di morte.
12. Chiudi i piatti con il loro coperchio trasparente. Sigilla i bordi delle piastre a 384 pozzi con nastro adesivo (applicando il nastro sopra la piastra e il coperchio), assicurandoti che il nastro non vada oltre il coperchio o sotto la piastra. Taglia il nastro tra coperchio e piastra a intervalli usando un bisturi per permettere lo scambio d'aria minimizzando l'evaporazione durante il saggio.
13. Inserisci la piastra nel lettore di piastre e avvia la riproduzione. Punta a eccitare a 365 nm e rilevare l'emissione a 435 nm ogni 2 minuti per 6-12 ore (Tabella 1).
    NOTA: Tipicamente, 6 ore sono sufficienti per saghi di stress termico a 42 °C e 8 ore per saghi di stress ossidativo al 7% t-BHP.

Tabella 1: Impostazioni di saggio ossidativo e da stress termico. Esempi di impostazioni utilizzate per i test di stress ossidativo (A) e termico (B) sui lettori di piastre fluorescenti utilizzati in questo studio.

Materials