Estrazione di batteri apoplastici utilizzando un metodo di pressione a base di siringa

Abstract

Fonte: Rufián, J. S., et al, Analisi a singola cellula dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae nel tessuto vegetale. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video mostra un metodo di pressione basato su siringa per estrarre batteri apoplastici, che proliferano e formano microcolonie all'interno dell'apoplasto, lo spazio intercellulare tra le cellule vegetali. Il metodo produce campioni batterici privi di detriti adatti all'analisi a valle di singola cellula.

Protocollo

Estrazione di batteri dall'apoplasto

1. Quattro giorni dopo l'inoculazione, si taglia o la parte aerea della pianta di Arabidopsis o la foglia inoculata della pianta di fagioli e si inserisce in una siringa da 20 mL senza ago (Figura 2G). Per le foglie di fagiolo, arrotola la foglia su se stessa, lasciando la faccia abassiale verso l'esterno, come mostrato nella Figura 2F.
2. Aggiungi un volume sufficiente di acqua distillata da coprire il tessuto (di solito 10-15 mL).
3. Inserisci lo sturalavandini e, con la siringa in posizione verticale con la punta rivolta verso l'alto, rimuovi l'eccesso d'aria e le bolle d'aria all'interno della siringa battendo delicatamente la canna finché tutta l'aria non si trova vicino alla punta. Fai scorrere lo sturalavandini per togliere l'aria. Quando c'è il minor numero possibile d'aria all'interno della siringa, copri la punta della canna con pellicola di paraffina.
4. Premere con attenzione lo sturalavandini per generare pressione positiva finché il tessuto non diventa più scuro (Figura 1I e Figura 2H). Poi, tira lo stantuffo per generare pressione negativa (Figura 1J e Figura 2I). Ripeti questo passaggio 3-5 volte.
5. Rimuovere la pellicola di paraffina e lo sturalavandini e raccogliere il liquido contenente i batteri estratti dall'apoplasto, come nella Figura 2J.

Risultati

Figura 1: Inoculazione batterica ed estrazione di apoplasti utilizzando piante di Arabidopsis. (A) Preparazione del vaso con la rete metallica correttamente fissata. (B)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 20 mL			Nessun requisito speciale
Tubi conici da 50 mL	Sarstedt
Parafilm	Imballaggi in plastica Pechiney
Pinzetta			Nessun requisito speciale
Camera a vuoto 25 cm di diametro	Kartell	554
Pompa a vuoto	GAST	DOA-P504-BN