Espressione indottibile della catena A della tossina ricina marcata con istidina in E. coli

Abstract

Fonte: Becker, B., et al. Un semplice saggio reporter basato sulla fluorescenza per identificare i componenti cellulari necessari al traffico della catena della tossina A (RTA) nel lievito. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video dimostra l'espressione indutibile della catena della tossina ricina A (RTA) marcata con His-in Escherichia coli. Descrive le fasi coinvolte nella coltivazione selettiva dei batteri trasformati con un plasmide di espressione ricombinante, nell'induzione dell'espressione RTA marcata con His e nella preparazione dei batteri per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Espressione eterologa della catena della tossina ricina A (RTA) marcata con His in Escherichia coli

1. Trasformare le cellule di Escherichia coli (E. coli) con il plasmide di espressione pET24-RTA_(His)6 o con il vettore vuoto pET24a⁽⁺⁾ utilizzando protocolli standard di elettroporazione. Le cellule contenenti il plasmide vuoto fungono da controllo negativo.
2. Dopo la selezione dei cloni positivi su piastre LB contenenti kanamicina (100 μg/mL) LB (Brodo di Lisogenesia), inoculare le cellule contenenti il plasmide di espressione RTA o il vettore vuoto in un mezzo_kan da 5 mL LB (mezzo LB con 100 μg/mL di kanamicina) e incubare a 37 °C e 220 giri/min per 24 ore.
3. Integrare 1 L LB_kan medium con 5 mL di pre-coltura e incubare le cellule a 37 °C e 220 giri/min finché le cellule non raggiungono un OD₆₀₀ di 0,8-1,0 (circa 3-4 ore). Successivamente, abbassare la temperatura della coltura a 28 °C e preparare una soluzione di stock isopropil-β-D-1-tiogalattipiranoside (IPTG) in H_2O.
4. Indurre l'espressione RTA di E. coli aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di 1 mM.
5. Dopo 3,5 ore a 28 °C e 220 giri/min, prelevare le cellule tramite centrifugazione a 10.000 x g e 4 °C per 10 minuti, lavare il pellet due volte con 5 mL di tampone di legame (500 mM NaCl, 10 mM imidazolo e 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,4) a 10.000 x g e 4 °C per 10 minuti, e risospendere il pellet in un buffer di legame da 5 mL.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in questa fase e le celle possono essere conservate a 80 °C per diversi giorni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppo batterico
Coli BL21 DE3 (Oro)	Tecnologie Agilent	230130
Plasmidi utilizzati in questo protocollo
pET24a⁽⁺⁾ (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA₍His₆₎
Reagenti
Medium per brodo LB	Thermo Scientific	10855021	Sono stati aggiunti 15 g di agar per la produzione di piastre
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G