Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di una proteina batterica ricombinante

Abstract

Fonte: Becker, B., et al. Un semplice saggio reporter basato sulla fluorescenza per identificare i componenti cellulari necessari al traffico della catena della tossina A (RTA) nel lievito. J. Vis. Esp. (2017).

Questo video dimostra la purificazione di una proteina ricombinante contrassegnata con poliistidina utilizzando cromatografia di affinità a base di nichel. Descrive i passaggi chiave, tra cui la lisi batterica tramite sonicazione, la chiarificazione e filtrazione del lisato, e il legame selettivo ed eluzione della proteina target tramite imidazolo.

Protocollo

1. Purificazione dell'RTA marcato con His tramite cromatografia di affinità

1. Sonicare le cellule sul ghiaccio seguendo il seguente protocollo: impulso di 15 s (20 micron), pausa di 30 s. Ripeti questo passaggio cinque volte.
2. Lisato delle celle centrifughe a 21.000 x g e 4 °C per 15 minuti e filtra il soprandanzante utilizzando un sistema di filtro a siringa sterile (poro di 0,2 μm).
   NOTA: I pellet cellulari di campioni sonicati con successo mostrano bordi trasparenti.
3. Utilizzare un sistema di purificazione automatico dotato di una colonna di affinità basata su Ni²+ da 5 mL per purificare la frazione RTA marcata con His dal supernatant E. coli sterile filtrato. In generale, usa una velocità di eluzione di 1 mL/min e raffredda l'intero sistema di purificazione per prevenire un legame inefficiente delle tossine e la perdita di attività tossica.
   NOTA: I parametri per una purificazione efficiente degli RTA sono elencati nella Tabella 1.
   1. In breve, bilanciare la colonna di affinità con 20 mL di buffer di legame per rimuovere il buffer di stoccaggio. Applicare il surnante sterile filtrato sulla colonna di affinità usando una siringa.
   2. Lavare la colonna con 25-35 mL di tampone di legame per rimuovere le proteine non legate dalla colonna. Esegui il passaggio di lavaggio finché l'assorbenza UV a 280 nm non è vicina al valore iniziale UV.
   3. Frazione RTA legata all'eluto in 20-35 mL di tampone di eluzione (500 mM imidazolo, 500 mM NaCl, 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,2) e mantenere il campione sul ghiaccio (Figura 1A e Figura 1B).
      NOTA: L'eluzione della frazione RTA è caratterizzata da un aumento dell'assorbimento UV. Si prega di notare di raccogliere esclusivamente questa frazione per prevenire la contaminazione da proteine legate aspecifiche.

Tabella 1: Parametri utilizzati per la purificazione e la desalinizzazione dell'affinità basata su colonne. Elenco di tutte le impostazioni rilevanti della colonna (ad esempio, portata, concentrazione del tamponamento di eluzione, equilibrio e durata del passaggio di lavaggio) e parametri misurati (ad esempio, conduttanza o assorbimento UV).

Parametro della cromatografia di affinità
Parametri di misura	UV (280 nm), concentrazione del tampone di eluzione, conduttanza
Impostazioni	Variabile/Unità	Valore
Portata	mL/min	1
Pressione massima della colonna	Mpa	0.35
Lunghezza d’onda	Nm	280 nm
Buffer di binding	Posizione della pompa	Un
Buffer di eluzione	Posizione della pompa	B
Buffer di eluzione di concentrazione iniziale	%	0
Compensazione del volume del sistema	Ml	10
Bilanciamento delle colonne	Ml	20
Iniezione di campione tramite superloop/siringa	Ml	Volume del lisato cellulare
Fase di lavaggio	Ml	20-35
Passaggio di eluzione	Ml	20-35
Tampone di eluzione di concentrazione durante l'eluzione	%	100
Ricalibrazione della colonna con EtOH al 20%	Ml	50
Parametro di desalinizzazione
Parametri di misura	UV (280 nm), Conduttanza
Impostazioni	Variabile/Unità	Valore
Portata	mL/min	4
Pressione massima della colonna	Mpa	0.35
Lunghezza d’onda	Nm	280 nm
Buffer di binding	Posizione della pompa	Un
Buffer di eluzione	Posizione della pompa	B
Buffer di eluzione di concentrazione iniziale	%	0
Compensazione del volume del sistema	Ml	10
Bilanciamento delle colonne	Ml	20
Iniezione di campione tramite superloop/siringa	Ml	Volume del lisato cellulare
Iniezione tampone di desalinizzazione (sorbitolo 0,8 M)	Ml	100
Ricalibrazione della colonna con EtOH al 20%	Ml	50

Risultati

Figura 1: Cromatografia di affinità rappresentativa e risultati di desalinizzazione delle cellule di E. coli contenenti pET-RTA_(His)6 o il controllo vettoriale vuoto. (A) Grafico tipico ...

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