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1. Preparazione della nanocellulosa batterica (BNC)
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni asettiche, salvo diversa indicazione.
- Prepara il mezzo di coltura.
- Prepara 500 ml di mezzo di coltura liquida combinando 25 g di estratto di lievito, 15 g di peptone, 125,0 g di manitolo e 500 ml di acqua ad alta purezza. Autoclave questa miscela a 120 °C per 20 minuti e conserva a 4 °C.
- Prepara 100 ml di substrato semisolido aggiungendo 15 g di agar a 5,0 g di estratto di lievito, 3,0 g di peptone, 25,0 g di manitolo e 100 ml di acqua ad alta purezza. Autoclava questa miscela a 120 °C per 20 minuti. Una volta autoclavata, depositare 5 ml della miscela in una piastra di Petri di plastica da 90 mm x 16 mm. Lascia gelificare la soluzione a 4 °C e conserva a questa temperatura fino a un ulteriore utilizzo.
- Reidrata il ceppo di Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus) conservato in fiale liofilizzate aggiungendo 1 ml di mezzo di coltura liquido e pipettando su e giù, come indicato dalle istruzioni del produttore.
- Inoculare le piastre di Petri contenenti substrati semisolidi con piccole gocce di sospensione batterica utilizzando un anello inoculante. Assicurati che l'inoculo copra l'intera piastra di Petri muovendo l'anello in direzione zigzag dal bordo al centro della piastra di vetro.
- Incubare le piastre di Petri a 26 °C per 72 ore in un incubatore senza CO2. Una volta completato il periodo di incubazione, sono visibili piccole colonie bianche. Se le colonie non vengono utilizzate immediatamente, conservare le piastre di Petri a 4 °C sigillando il coperchio con Parafilm e posizionando le piastre a testa in giù. Le colonie possono essere conservate in questo modo fino a 6 mesi.
- Trasferire 2 ml del mezzo di coltura liquida in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi. Prendi due colonie con un ago inoculante dalle piastre di Petri inoculate e inserile nel primo pozzo della piastra di coltura tissutale. Ripeti la stessa procedura per i restanti 23 pozzi.
- Incubare la piastra di coltura a 30 °C per 7 giorni. Questo produrrà un totale di 24 pellicole BNC con un diametro di 16 mm e uno spessore di circa 2-3 mm, come mostrato nella Figura 1. Nota: Non disturbare la coltura batterica in nessun momento durante il periodo di incubazione, ad esempio scuotendo le piastre. Durante il periodo di incubazione, G. xylinus estrude molecole di zucchero di glucopiranosio per formare una rete cristallina polimerica nell'interfaccia aria-liquido, che adotta la forma e la dimensione della fiaschetta in condizioni di coltivazione statiche. Questa matrice polimerica, nota come nanocellulosa batterica (BNC), è evidente alla fine del periodo di incubazione.
- Raccogliere le pellicole BNC dal substrato di crescita e sterilizzarle in 200 ml di soluzione di NaOH all'1% per 1 ora a 50 °C, in modo da rimuovere tutte le tracce di G. xylinus. Opzionalmente, mescola questa soluzione a 300 giri/min usando una barra magnetica e una piastra di mescolatura. Scartare la soluzione di NaOH e aggiungere 200 ml di soluzione di NaOH appena preparata all'1%. Ripeti lo stesso processo ancora una volta o finché le pellicole BNC in soluzione acquisiranno un aspetto traslucido.
- Risciacqua le pellicole BNC con acqua tre volte e conservale in acqua ad alta purezza al tempo di RT. Assicurati che le pellicole BNC siano completamente immerse nell'acqua e non possano mai asciugare.
- Autoclave le pellicole BNC a 121 °C per 20 minuti. Nota: Uno studio sottocutaneo in vivo sul ratto condotto da Märtson e colleghi non ha mostrato segni di degrado del BNC dopo 60 settimane di impianto. Infatti, il BNC è degradabile in natura da enzimi microbici e fungini, assenti nei mammiferi. D'altra parte, la biodegradabilità del BNC può essere il risultato di processi meccanici, chimici e biologici che indeboliscono la rete microfibrillica in vivo.
