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1. Preparazione di sostanze chimiche e attrezzature
1. Produrre 500 ml di una soluzione di esametafosfato di sodio (SHMP) (NaPO3)n all'1% e sterilizzarla tramite autoclav.
2. Sterilizzare i filtri della nitrocellulosa (NC) (poro dimensione 0,22 μm, diametro 47 mm) tramite autoclavaggio in piastre di Petri di vetro chiuse.
3. Sterilizza i filtri NC (dimensione pori 0,22 μm, diametro 25 mm) tramite autoclavaggio in piastre di Petri di vetro chiuse.
4. Pesare e annotare il peso a vuoto dei tubi sterili da 50 ml (con tappo montato) (un tubo per campione).
5. Preparare il tampone Tris-EDTA (TE-buffer) 1x: preparare una soluzione di 10 mM di Tris (tris(idrossimetil)amminatomano) e 1 mM di tampone EDTA. Regola il pH a 8 e sterilizza tramite autoclav.
6. Preparare la soluzione di lisozima (20 mg/ml) sciogliendo 0,02 g di lisozima in 1 ml di TE-buffer. Idealmente, renderlo fresco ogni volta. Conserva a 4 °C per non più di una settimana.
7. Preparare una soluzione fisiologica sciogliendo 8 g/L di cloruro di sodio (NaCl) in acqua distillata. Sterilizza tramite autoclav.
2. Separazione della biomassa dai sedimenti
1. Aggiungere 3 g di campione di sedimento a tubi sterili pre-pesati da 50 ml utilizzando cuilai metallici fiammati a etanolo. Esegui questo in un armadietto di biosicurezza pulito e sterilizzato ai raggi UV per evitare contaminazioni.
2. Aggiungere 15 ml di una soluzione SHMP sterile (autoclavata) all'1% al campione utilizzando una buretta graduata sterile. La soluzione SHMP può anche essere filtrata per evitare contaminazioni.
3. Omogeneizzare la soluzione sedimentaria e SHMP con un dispersore/omogeneizzatore liquido (ad esempio, omogeneizzatore Ultra-Turrax). Sterilizza il rotore di dispersione al 70% con etanolo o autoclave prima dell'uso. Fai partire l'omogeneizzazione per 1 minuto a 17.500 giri/min. Lascia riposare il campione per 2 minuti e ripeti l'omogeneizzazione per 1 minuto alla velocità del rotore.
4. Lasciare riposare il campione per 10 minuti. In questo passo, le particelle più pesanti (minerali) si depositano. Le cellule e eventuali componenti organici del campione, tuttavia, rimarranno in soluzione. Successivamente, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in un tubo pulito da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet di sedimento.
5. Alla pellet di sedimenti, aggiungere ancora 15 ml di una soluzione SHMP sterile (autoclavata) all'1% utilizzando una buretta graduata sterile. Poi ripeti i passaggi 2.3 e 2.4. Questa ripetizione garantisce la separazione della massima quantità di cellule e particelle organiche dalla componente minerale del sedimento. Il soprantantante di questa seconda separazione può essere fuso con quello della prima separazione.
Nota: I passaggi seguenti vengono tutti eseguiti sul sovranante (contenente biomassa cellulare). La componente minerale (pellet di sedimenti) può essere scartata.
6. Centrifuga il campione a 20 x g per 1 minuto. Questo passaggio aumenta la forza g abbastanza da depositare piccole particelle minerali mentre il materiale cellulare biologico rimane ancora in soluzione. Dopo la centrifugazione, trasferire la soluzione soprantantante (contenente biomassa cellulare) in un tubo pulito da 50 ml. Scarta la pellet minerale.
7. Determinare il volume finale della soluzione contenente biomassa pesando il campione. La determinazione del peso evita di dover trasferire il campione in un cilindro graduato e riduce il rischio di contaminazione.
3. Raccolta di biomassa sulla membrana filtrante
1. Preparare un'unità di filtrazione (per membrane di 47 mm di diametro) e una pompa a vuoto. Sterilizza l'unità di filtrazione tramite autoclavaggio o (se vetro Pyrex) spruzzandola con etanolo al 70% e fiammandola con un bruciatore Bunsen. Lascia raffreddare prima di continuare con il protocollo.
2. Aggiungere una membrana NC sterile all'unità di filtrazione usando pinze sterilizzate con fiamma a etanolo.
3. Aggiungere metà del campione sovrantante (dal passo 2.6) all'unità di filtrazione a membrana e raccogliere le cellule sulla membrana usando la pompa a vuoto.
4. Quando il liquido è passato completamente attraverso il filtro, fermare la pompa a vuoto e rimuovere con cura la membrana usando pinze sterilizzate con etanolo e fiamma. Inserire la membrana in una piastra di Petri sterile.
1. Taglia la membrana a metà usando forbici sterilizzate con fiamma a etanolo. Aggiungi ogni metà della membrana a un tubo separato da 2 ml. Metà della membrana sarà utilizzata per l'estrazione del DNA e l'analisi dell'intera comunità batterica. L'altra metà del filtro sarà conservata a -80 °C e funge da riserva.
5. Posizionare una nuova membrana NC sull'unità di filtrazione e raccogliere biomassa dalla seconda metà del volume del campione (dal passo 2.6) utilizzando la pompa a vuoto.
6. Quando il liquido è passato completamente attraverso il filtro, fermare la pompa a vuoto e rimuovere con cura la membrana usando forze sterilizzate con fiamma a etanolo. Metti l'intera membrana in un tubo separato da 2 ml. Questo campione sarà utilizzato per il trattamento per separare endospore dalle cellule vegetali. Il campione può essere conservato a -20 °C fino all'uso.
4. Lisi delle cellule vegetative
1. Eseguire il trattamento per separare le endospore dalle cellule vegetali sulla biomassa precedentemente raccolta su una membrana NC (passo 3.6).
1. Se la membrana era congelata, lasciala a RT per 10 minuti per scongelarla. Poi, posiziona la membrana in una piastra di Petri sterile e tagliala (circa 4 volte) in pezzi più piccoli usando forbici sterilizzate con fiamma a etanolo. Poi, posiziona tutti i pezzi del filtro a membrana in un tubo sterile da 2 ml.
2. Aggiungere 900 μl di tampone 1x TE (Tris-EDTA) (vedi 1.5) al tubo contenente la membrana campione e mescolare accuratamente tramite vortice. In questo passaggio, la biomassa viene rimossa dalla membrana nella soluzione tampone TE.
3. Mettere il tubo in un incubatore a 65 °C per 10 minuti e 80 giri/min. Dopodiché, rimuovi il tubo dall'incubatrice e lascialo raffreddare per 15 minuti.
4. Aggiungere 100 μl di lisozima appena preparato (vedi 1,5) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mg/ml. Non aggiungere il lisozima prima che il campione si sia raffreddato a 37 °C, poiché questo potrebbe degradare l'enzima.
5. Incubare il campione a 37 °C per 60 minuti e 80 giri al minuto, le condizioni ottimali affinché il lisozima lisi le cellule vegetali.
6. Dopo il completamento della lisi, aggiungere 250 μl di idrossido di sodio (NaOH) al 3 N e 250 μl di soluzione al 6% di solfato di dodecile di sodio (SDS) al campione. Aggiungendo questo, il volume del campione raggiunge 1,5 ml, con una concentrazione finale di 0,5 N NaOH e una concentrazione finale dell'1% SDS.
7. Incubare questo mix a RT per 60 minuti e 80 giri/min. Aggiungere la base e i detersivi aiuterà nella lisi cellulare finale. La concentrazione di questi detersivi è stata ottimizzata per non danneggiare le endospore durante la lisi delle cellule vegetali.
8. Prepara un'unità di filtrazione sterile che regge membrane di 25 mm di diametro tramite autoclaving o (se vetro Pyrex) spruzzandola con etanolo al 70% e fiammandola con un bruciatore Bunsen. Lascia raffreddare.
9. Posizionare una membrana NC da 0,2 μm (diametro 25 mm) sull'unità di filtrazione utilizzando pinze sterilizzate con etanolo e fiamma.
10. Aggiungere il campione del passo 4.7 sulla membrana e filtrare il liquido usando la pompa a vuoto. Quando il liquido è passato, spegni la pompa del vuoto. In questa fase, il materiale cellulare vegetativo lisato viene rimosso, poiché non viene trattenuto sulla membrana. Solo le endospore rimarranno sulla membrana.
11. Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile per lavare via i detersivi residui e filtrare il liquido utilizzando la pompa a vuoto.
12. Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa a vuoto. Lascia la membrana sull'unità di filtrazione.