Generazione di colture batteriche pure in un mezzo liquido

Abstract

Fonte: Brumfield, K. D. et al., Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae . J. Vis. Esp. (2017)

Questo video mostra la crescita delle colture batteriche in un mezzo liquido. Lo scuotimento favorisce l'aerazione e distribuisce i nutrienti in modo uniforme, supportando una crescita esponenziale e risultando in una sospensione uniforme e metabolicamente attiva, adatta alle applicazioni a valle.

Protocollo

1. Mantenimento e crescita dei ceppi di Vibrio cholerae

1. Preparazione e utilizzo delle colture di stock congelato
   1. Pellet 1,8 mL di coltura liquida durante la notte per 2 minuti tramite centrifugazione (≥8.600 x g) in un tubo microcentrifuga sterile da 2 mL, rimuovere il surnatant e risospendere il pellet cellulare in 900 μL di brodo fresco Luria-Bertani (LB) tramite pipetta.
   2. Aggiungi 900 μL di glicerolo sterile al 60% (v/v) alla coltura e mescola tramite vortex.
   3. Trasferire la miscela in un tubo criogenico sterile da 2 mL e conservarla indefinitamente a -80 °C.
   4. Per utilizzare, rimuovere una piccola quantità di stock congelato utilizzando un anello e striatura inoculante sterile per le singole colonie su piastre di agar LB. Riporta immediatamente il stock congelato a -80 °C dopo l'uso per evitare che le colture si scongelino completamente. Incubare le piastre con il copru verso il basso per 12-16 ore a 37 °C.
2. Crescita di colture notturne in mezzo liquido
   1. Striscia per colonie singole (come della sezione 1.1.4) da stock congelato su piastre di agar LB. Incubare le piastre con il copru verso il basso per 12-16 ore a 37 °C.
   2. Inoculare 4 mL di brodo LB liquido in un tubo di coltura sterile da 10 mL con una singola colonia toccando la superficie della singola colonia con un applicatore sterile e trasferindo la colonia nel brodo liquido.
   3. Incubare con aerazione in un incubatore shaker a 225 giri al minuto (rpm) per 12-16 ore a 37 °C.

Materiali