Blocco di replicazione mediato da proteine repressore marcato fluorescente in Escherichia coli

Abstract

Fonte: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induzione di un blocco di replicazione site-specific in E. coli usando un sistema operatore repressore fluorescente. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra il blocco della forchetta di replicazione site-specific in Escherichia coli utilizzando l'espressione indotta dall'arabinosio di TetR fluorescente giallo marcato con proteine che lega le matrici cromosomiche di tetO.

Protocollo

1. Bloccare la replicazione con il sistema operatore a repressore di fluorescenza (FROS)

1. Induzione dell'ostruzione della replicazione
   1. Diluire una coltura fresca notturna di un ceppo di E. coli che trasporta un array tetO e pKM118 fino a_{OD 600}nm = 0,01 in un mezzo complesso diluito (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M_{K 2HPO 4}) con antibiotici necessari per la selezione.
      NOTA: Non aggiungere tetraciclina per la selezione poiché non è compatibile con questo sistema. Fai in modo che il volume della coltura equivalga a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale nella Figura 1 è di 60 ml.
   2. Crescere a 30 °C con scuotimento fino a OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Rimuovere un campione da 10 ml da servire come controllo non indotto e aggiungere lo 0,1% di arabinosio alla coltura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a coltivare sia le colture non indotte che quelle indotte. Dopo 1 ora, verifica la presenza di un singolo punto focale all'interno di ciascuna cella della coltura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza.
   3. Se le cellule indotte sono confermate bloccate (più del 70% delle cellule ha un unico focus), registrare la OD₆₀₀nm e prelevare un campione da 7,5 ml per l'analisi con gel 2D. Prelevate un campione equivalente dalla coltura di controllo non indotta.

Risultati

Figura 1: Panoramica della procedura sperimentale FROS Replication Block and Release Experimental. I ceppi di E. coli che trasportano l'array tetO sono coltivati a 30 °C. Quando le cellule raggiungono un OD_{di 600}nm superiore...

Materiali