Blocco di replicazione mediato da proteine repressore marcato fluorescente in Escherichia coli

Abstract

Fonte: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induzione di un blocco di replicazione site-specific in E. coli usando un sistema operatore repressore fluorescente. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra il blocco della forchetta di replicazione site-specific in Escherichia coli utilizzando l'espressione indotta dall'arabinosio di TetR fluorescente giallo marcato con proteine che lega le matrici cromosomiche di tetO.

Protocollo

1. Bloccare la replicazione con il sistema operatore a repressore di fluorescenza (FROS)

1. Induzione dell'ostruzione della replicazione
   1. Diluire una coltura fresca notturna di un ceppo di E. coli che trasporta un array tetO e pKM118 fino a_{OD 600}nm = 0,01 in un mezzo complesso diluito (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M_{K 2HPO 4}) con antibiotici necessari per la selezione.
      NOTA: Non aggiungere tetraciclina per la selezione poiché non è compatibile con questo sistema. Fai in modo che il volume della coltura equivalga a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale nella Figura 1 è di 60 ml.
   2. Crescere a 30 °C con scuotimento fino a OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Rimuovere un campione da 10 ml da servire come controllo non indotto e aggiungere lo 0,1% di arabinosio alla coltura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a coltivare sia le colture non indotte che quelle indotte. Dopo 1 ora, verifica la presenza di un singolo punto focale all'interno di ciascuna cella della coltura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza.
   3. Se le cellule indotte sono confermate bloccate (più del 70% delle cellule ha un unico focus), registrare la OD₆₀₀nm e prelevare un campione da 7,5 ml per l'analisi con gel 2D. Prelevate un campione equivalente dalla coltura di controllo non indotta.

Risultati

Figura 1: Panoramica della procedura sperimentale FROS Replication Block and Release Experimental. I ceppi di E. coli che trasportano l'array tetO sono coltivati a 30 °C. Quando le cellule raggiungono un OD_{di 600}nm superiore...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Triptone	Sigma-Aldrich	16922	Componente dei mezzi di crescita
Cloruro di sodio	VWR	27810.364	Componente dei mezzi di crescita
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	92144	Componente dei mezzi di crescita
Monobasico fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P9791	Componente dei mezzi di crescita; Componente tampone di potassio
Dibase fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P3786	Componente dei mezzi di crescita; Componente tampone di potassio
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	Per l'induzione della produzione del TetR-YFP
Microscopio a fluorescenza Axioskop 2	Zeiss	452310	Visualizzazione delle celle
Set di filtri eYFP	Tecnologia Chroma	41028	Visualizzazione di YFP
Telecamera CCD	Hamamatsu	Orca-AG	Visualizzazione delle celle
Software MetaMorph (Dispositivi Molecolari)	SDR Scientific	31282	Versione 7.8.0.0 utilizzata nella preparazione di questo manoscritto