Amplificazione isotermica mediata ad annello per il rilevamento di geni batterici

Abstract

Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della salmonella in alimenti animali e la conferma della salmonella tramite isolamento in coltura. J. Vis. Esp. (2020).

Questo video dimostra la tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) per rilevare un gene batterico bersaglio amplificando il DNA a temperatura costante. La miscela di reazione viene preparata aggiungendo un mix master isotermico, primer specifici per il gene bersaglio e campioni contenenti template di DNA. L'amplificazione viene avviata in uno strumento LAMP e viene monitorata la fluorescenza in tempo reale per confermare la presenza del gene bersaglio.

Protocollo

NOTA: Una miscela di reazione ad amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) contiene DNA polimerasi, tampon, solfato di magnesio (_{MgSO 4}), trifosfati di desossinucleotidi (dNTP), primer, modello di DNA e acqua. I primi quattro reagenti sono contenuti in un mix master isotermico (Tabella dei Materiali). I primer vengono premiscelati internamente per diventare un mix di primer (10 volte). I modelli di DNA possono essere preparati da brodi di arricchimento di campioni di cibo animale per scopi di screening o da colture di isolati presuntivi di Salmonella per scopi di conferma. Inoltre, in ogni prova LAMP sono inclusi un controllo positivo (DNA estratto da qualsiasi ceppo di riferimento di Salmonella , ad esempio Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) e un controllo senza modello (NTC; acqua sterile di grado molecolare).

1. Preparazione di modelli di DNA

1. Per preparare modelli di DNA a partire da arricchimenti alimentari animali, segui questi passaggi.
   1. Pesano asepticamente 25 g di un campione di cibo animale (ad esempio, cibo secco per gatti, cibo secco per cani, mangime per bovini, mangime per cavalli, mangime per pollame e mangime per suini) in un sacchetto filtro sterile (Tabella dei materiali), o equivalente. Metti il sacchetto in un grande contenitore o in un portafoglio per supporto durante l'incubazione.
   2. Aggiungi 225 mL di acqua peptonica sterile tamponata (BPW). Mescola bene con un vortice e un breve massaggio alle mani. Lascia riposare a temperatura ambiente per 60 ± 5 minuti.
   3. Mescola bene facendo roteare e determina il pH con un foglio di prova. Regolare il pH, se necessario, a 6,8 ± 0,2 con acido sterile 1 N idrossido di sodio (NaOH) o 1 N cloridrico (HCl). Incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   4. Mescola bene facendo roteare la busta contenente brodi per l'arricchimento di cibo animale. Trasferisci 1 mL dal lato filtrato della sacca a un tubo microcentrifuga. Vortice per un attimo.
   5. Estrarre il DNA utilizzando un reagente per la preparazione del campione (Tabella dei Materiali) come segue.
      1. Centrifugare a 900 x g per 1 minuto per rimuovere particelle grandi e trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga.
      2. Centrifuga a 16.000 x g per 2 minuti e scarta il surnadante.
      3. Sospendere il pellet in 100 μL del reagente per la preparazione del campione e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco.
      4. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare gli estratti di DNA del campione a -20 °C.
2. Per preparare modelli di DNA da colture presuntive di Salmonella , segui questi passaggi.
   1. Ottenere isolati presuntivi di Salmonella dall'isolamento in coltura in tutti gli alimenti secondo il Capitolo 5, sezione D della FDA BAM, sezione D sulla Salmonella.
   2. Inoculare gli isolati presuntivi di Salmonella su una piastra agar non selettiva (ad esempio, agar di sangue, agar nutritivo e agar di soia tripticasa) e incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   3. Trasferire diverse colonie singole a 5 mL di brodo di soia tripticase (TSB) o brodo per infusione cerebrale cardiaca (BHI) e incubare a 35 ± 2 °C per 16 ± 2 ore.
      NOTA: Questo passaggio può essere opzionale se la presunta coltura di Salmonella è pura. In tal caso, i modelli di DNA possono essere preparati sospendendo diverse colonie singole in 5 mL di TSB e riscaldando 500 μL della sospensione a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco. Continua con il passo 5 qui sotto.
   4. Trasferire 500 μL della coltura notturna in un tubo microcentrifuga e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore a secco.
   5. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare estratti di DNA isolati a -20 °C.
3. Per preparare il DNA di controllo positivo, segui passaggi simili a quelli sopra per preparare modelli di DNA da colture presuntive di Salmonella con un passaggio aggiuntivo di diluizione.
   1. Inoculare S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) o qualsiasi ceppo di riferimento di Salmonella su una piastra agar non selettiva (ad esempio, agar di sangue, agar nutritivo e agar di soia tripticasa) e incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   2. Trasferire diverse colonie singole in 5 mL di brodo TSB o BHI e incubare a 35 ± 2 °C per 16 ± 2 ore per raggiungere ~10⁹ CFU/mL.
   3. Diluire serialmente la coltura notturna in acqua con peptone allo 0,1% per ottenere ~10⁷ CFU/mL.
   4. Trasferire 500 μL di questa diluizione in un tubo per microcentrifuga e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore a secco.
   5. Raffredda a temperatura ambiente e conserva il DNA di controllo positivo a -20 °C.

2. Preparazione della miscela del primer (10 volte)

1. Ottenere primer LAMP sintetizzati commercialmente (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF e Sal4-LB) con purificazione standard per desalinizzazione (Tabella 1). Prepara soluzioni stock di ciascun primer (100 μM) reidratando il primer con una quantità adeguata di acqua sterile di grado molecolare. Mescola bene vorticando per 10 secondi e conserva a -20 °C (-80 °C per la conservazione a lungo termine).
2. Prepara la miscela di primer (10 volte) secondo un foglio di lavoro (Tabella 2). Aggiungi volumi appropriati di soluzioni di primer stock e acqua sterile di grado molecolare in un tubo microcentrifuga. Mescola bene tutti i reagenti vorticando per 10 secondi. Aliquota la miscela di primer 10x a 500 μL per tubo microcentrifuga e conserva a -20 °C.

3. Assemblaggio di una reazione LAMP

NOTA: Per prevenire la contaminazione incrociata, è fortemente raccomandato separare fisicamente le aree utilizzate per preparare il master mix LAMP e aggiungere i template di DNA. La Figura 1 è un diagramma LAMP.

1. Preparazione e preparazione della corsa
   1. Pulire il banco con isopropanolo e una soluzione degradante di DNA e DNasi (Tabella dei materiali). Pulire le pipette e i porta-strisce per tubi (Tabella dei materiali) con la soluzione degradante di DNA e DNasi.
   2. Scongelare il mix master isotermico, il primer mix (10 volte), l'acqua di grado molecolare, il DNA di controllo positivo e i template di DNA a temperatura ambiente.
   3. Accendi lo strumento LAMP (Tabella dei Materiali) e tocca la schermata di apertura per accedere alla schermata principale. Segui questi passaggi per creare una run.
      NOTA: Un modello dello strumento LAMP ha 2 blocchi (A e B) con 8 campioni in ciascun blocco, e un altro modello ha un singolo blocco che può ospitare 8 campioni (Tabella dei materiali).
      1. Tocca LAMP+Anneal e seleziona Modifica per inserire le informazioni sul campione.
         NOTA: Il profilo di corsa predefinito di LAMP consiste in amplificazione a 65 °C per 30 minuti e una fase di anneal da 98 °C a 80 °C con una decremento di 0,05 °C al secondo.
      2. Tocca ogni riga di campione per attivare il cursore e inserire le informazioni rilevanti del campione, utilizzando l'icona del blocco AB per passare tra i due blocchi strumenti LAMP.
      3. Tocca l'icona Check quando tutte le informazioni sull'esempio sono state inserite.
         NOTA: Opzionalmente, la configurazione di esecuzione (chiamata "Profile", che contiene informazioni di campione insieme al profilo di esecuzione predefinito di LAMP) può essere salvata per un uso successivo. Tocca l'icona Salva e assegna un nome unico al profilo. Quando si testa lo stesso insieme di campioni la volta successiva, si può avviare una nuova esecuzione utilizzando il profilo salvato. Tocca l'icona Cartella in basso a sinistra della schermata principale e seleziona Profilo per caricare i profili salvati.
2. Assemblaggio di reazione LAMP
   NOTA: Quando si utilizzano entrambi i blocchi di strumenti LAMP (A e B, per un totale di 16 campioni), preparare il master mix LAMP per 18 campioni. Se si utilizza un solo blocco di strumenti LAMP (8 campioni in totale), prepara il master mix LAMP per 10 campioni. Per altri numeri di campione, regola il volume di conseguenza per gestire la perdita da pipetta. Includi sempre un controllo positivo e un NTC in ogni esecuzione di LAMP. Si raccomanda il duplicare il test di ogni campione in esecuzioni LAMP indipendenti.
   1. Prepara il master mix LAMP secondo un foglio di lavoro (Tabella 3). Aggiungi i volumi appropriati della miscela master isotermica, della miscela di primer e dell'acqua di grado molecolare in un tubo per microcentrifuga e fai un vortice delicato per 3 secondi. Centrifuga brevemente.
   2. Posiziona la striscia per tubi nel portastrische e distribuisci 23 μL del master mix LAMP in ciascun pozzo.
   3. Vortice tutti i template di DNA e centrifuga brevemente. Aggiungi 2 μL di modello di DNA nel pozzo appropriato e tappa strettamente.
   4. Rimuovi la striscia del tubo dal supporto e muovi il polso per assicurarti che tutti i reagenti si siano concentrati sul fondo del tubo.
   5. Carica la striscia del tubo nel blocco strumenti LAMP, assicurandoti che i tappi siano ben ben fissi prima di chiudere il coperchio.

4. Corso LAMP

NOTA: Durante una corsa LAMP, le letture di fluorescenza vengono acquisite utilizzando il canale FAM. I valori del tempo fino al picco (Tmax; min) sono determinati automaticamente dallo strumento per il momento in cui il rapporto di fluorescenza raggiunge il valore massimo della curva del tasso di amplificazione. Il Tm (°C) è la temperatura di fusione/ricottura del prodotto finale amplificato.

1. Clicca sull'icona Run in alto a destra dello schermo e seleziona il/i blocco contenente la striscia dei tubi per avviare la corsa LAMP.
2. Opzionalmente, mentre la reazione è in corso, tocca le schede Temperatura, Amplificazione e Anneal per vedere i cambiamenti dinamici di vari parametri durante l'esecuzione del LAMP.
3. Una volta completata la corsa, tocca le schede Amplificazione e Anneal per vedere le curve complete di amplificazione e anneal, e tocca la scheda Risultati per visualizzare i risultati.
4. Opzionalmente, per la registrazione dei registri, registra il numero di esecuzione situato in alto a sinistra dello schermo, usando il formato di "numero di number_run di serie strumentale", ad esempio "GEN2-2209_0030."

Tabella 1: Primer LAMP per lo screening di Salmonella negli alimenti animali e la conferma di Salmonella da isolamento in coltura. I primer sono progettati sulla base della sequenza Salmonella invA (numero di accesso GenBank M90846).

Nome di guida	Descrizione	Sequenza (5'-3')	Lunghezza (bp)
Sal4-F3	Primer esterno anteriore	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Primer esterno all'indietro	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Primer interno anteriore	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Primer interno all'indietro	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Primer ad anello in avanti	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Innesco all'indietro ad anello	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabella 2: Scheda di lavoro per preparare la miscela del primer LAMP (10 volte). Gli innesco sono elencati nella Tabella 1.

Componente	Conc. di calcio (μM)	Miscela di primer conc. (μM)	Volume (μL)
Primer Sal4-F3	100	1	10
Primer Sal4-B3	100	1	10
Primer Sal4-FIP	100	18	180
Introduzione Sal4-BIP	100	18	180
Primer Sal4-LF	100	10	100
Primer Sal4-LB	100	10	100
Acqua di grado molecolare	N/A	N/A	420
Totale	N/A	N/A	1000

Tabella 3: Scheda di lavoro per preparare il mix di reazione LAMP. La miscela di primer (10x) viene preparata secondo la Tabella 2 utilizzando soluzioni standard di primer elencate nella Tabella 1.

Componente	Lavorando in concentrazione.	Reazione finale conc.	Volume per campione (μL)	Volume per 18 campioni (μL)	Volume per 10 campioni (μL)
Miscelazione isotermica isotermica ISO-001	1,67x	1x	15	270	150
Miscela primer	10x	1x	2.5	45	25
Acqua di grado molecolare	N/A	N/A	5.5	99	55
Sottototale master mix	N/A	N/A	23	414	230
Modello del DNA	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Risultati

Figura 1: Un diagramma schematico del flusso di lavoro Salmonella LAMP.

Materiali