Distribuzione tramite elettroporazione di biomolecole fluorescenti nelle cellule batteriche

Abstract

Fonte: Aigrain, L., et al. Internalizzazione e osservazione di biomolecole fluorescenti in microrganismi viventi tramite elettroporazione. J. Vis. Esp. (2015)

Il video dimostra la consegna di biomolecole fluorescenti nelle cellule microbiche elettrocompetenti tramite elettroporazione. Il processo inizia con l'introduzione di DNA o proteine marcate con fluorofori in una sospensione cellulare raffreddata. Viene quindi applicato un impulso ad alta tensione per creare pori temporanei di membrana, permettendo l'ingresso della biomolecola nel citoplasma. Dopo il recupero, le cellule vengono sottoposte a lavaggio e filtrazione per rimuovere molecole non internalizzate o legate alla superficie. Infine, le cellule marcate vengono montate per immagini a fluorescenza per visualizzare i componenti intracellulari.

Protocollo

1. Elettroporazione

1. Incubazione
   1. Aggiungi fino a 5 μl di molecole marcate immagazzinato in un tampone a basso contenuto di sale (< 50 mM di sale) a una singola aliquota di cellule competenti (batteri da 20 μl o lievito da 50 μl) e incuba per 10 minuti sul ghiaccio.
      NOTA: La concentrazione di molecole marcate fluorescentmente nelle soluzioni standard e quindi la quantità di molecole marcate aggiunte alla cella prima dell'elettroporazione sono direttamente correlate con l'efficienza del carico (Figura 1 e Discussione). Poiché alcune proteine sono meno compatibili con condizioni a basso contenuto di sale, la concentrazione di sale nel buffer di stoccaggio potrebbe aumentare, ma il volume di molecole marcate aggiunto alle cellule prima dell'elettroporazione deve quindi essere ridotto.
   2. Trasferire la miscela di cellule e biomolecole marcate in una cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata (con distanziamento di 0,1 e 0,2 cm rispettivamente per batteri e lieviti). Tocca delicatamente la cuvetta sul banco per rimuovere eventuali bolle dalla soluzione.
   3. Inserire la cuvetta nell'elettroporatore e applicare un impulso elettrico ad alta tensione alla soluzione (0,9-1,8 kV/cm, vedi Discussione per maggiori dettagli sulla scelta della tensione). Un tale impulso forma pori transitori nelle membrane cellulari, permettendo alle biomolecole marcate di diffondersi nelle cellule.
   4. Controlla che la costante di tempo visualizzata sull'elettroporatore sia compresa tra 4 e 6 ms. Le costanti di tempo più basse sono spesso dovute a una concentrazione di sale troppo alta e/o alla presenza di bolle nella cuvetta, e portano a un carico molto basso o nullo delle celle.
2. Guarigione
   1. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 μl di mezzo ricco come Super Optimal Broth con repressione Catabolitica (SOC), EZ Rich Defined Medium, estratto di lievito Peptone Dextrosio (YPD) o qualsiasi mezzo ricco alle cellule.
   2. Incubare il campione a 37 °C per batteri e 29 °C per lieviti per 2-10 minuti. Per le misurazioni di vitalità, dove l'utente vuole valutare la percentuale di cellule che crescono e si dividono dopo l'elettroporazione, si utilizza un tempo di recupero più lungo (fino a 1 ora) poiché osserviamo tali ritardi prima della prima divisione cellulare.
3. Fasi di lavaggio
   1. Lavare le cellule per rimuovere eventuali biomolecole non internalizzate facendo girare le cellule per 1 minuto a 3300 x g e 4 °C. Scartare il soprandanante e risospendere le cellule in 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: Per ogni campione, preparare un controllo negativo delle cellule incubate con la stessa quantità di biomolecole marcate ma non elettroporate e lavate esattamente allo stesso modo del campione principale.
   2. Ripeti i passaggi precedenti 3 volte.
   3. Nel caso dell'interiorizzazione proteica, ottimizzare la procedura di lavaggio in base alle proprietà e al comportamento della proteina marcata di interesse. I seguenti passaggi sono esempi di possibili ottimizzazioni:
      1. Esegui i primi tre cicli di lavaggio utilizzando PBS contenente 100 mM di NaCl e 0,005% di Triton X-100 per rimuovere le proteine non internalizzate che potrebbero aderire alla membrana cellulare esterna.
         1. Filtrare le celle elettroporate con un filtro di 0,22 μm di diametro per i pori inserito in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml pipettando le celle elettroporate nel filtro. Centrifuga per 3 minuti a 800 x g e 4 °C. Elimina il flow-through. Aggiungi 500 μl di nuovo PBS sulle celle e girale di nuovo come prima, ripetendo questi passaggi una volta.
      2. Aggiungere una piccola quantità di proteasi K (10 ng in 500 μl PBS) durante il primo ciclo di lavaggio per permettere la digestione di qualsiasi proteina non interiorizzata.
   4. Fai girare le cellule per 1 minuto a 3300 x g e 4 °C. Scartare il sovrantantante e risospendere le celle a 150 μl di PBS.
   5. Distribuire la soluzione della cella carica sul tampone di agarosio rimuovendo il copertura superiore e diffondendo 10 μl della cella goccia per goccia. Sostituisci una copertura pulita e bruciata inutilizzata (non spessore 1,5, corrispondente alle specifiche dell'obiettivo del microscopio) sulla parte superiore del tampone e premi molto delicatamente sul vetrino.
   6. Proteggi le celle elettroporate dalla luce conservando i pad in una scatola opaca mentre si fanno immagini di diversi campioni.

Risultati

Figura 1: Conteggio del numero di molecole interiorizzate tramite l'analisi da fotosbiancamento. (A) Analisi di fotosbiancamento a singola cellula. Esempi di tracce temporali di intensità di fluorescenza (blu: dati grezzi;...

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