Preparazione di campioni di Myxococcus xanthus per l'imaging di cellule vive

Abstract

Fonte: Schumacher, D., et al. Imaging a fluorescenza con cellule vive dell'intero ciclo cellulare vegetativo del batterio sociale a lenta crescita Myxococcus xanthus. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video mostra la preparazione e l'imaging di Myxococcus xanthus, un batterio del suolo a crescita lenta. La coltura viene coltivata in un mezzo, applicata su una copertura con microsfere fluorescenti e sovrapposta con un tappeto di agarosio preriscaldato per sostenere l'idratazione e l'apporto di nutrienti. Questa configurazione consente immagini live a lungo termine e in time-lapse dei processi cellulari durante la divisione cellulare batterica.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di microscopia

Nota: Le cellule da osservare al microscopio vengono poste su un coperto del microscopio e poi coperte da un tampone di agarosio contenente nutrienti. Il copricopere viene incollato a un telaio in plastica o metallo per fornire supporto meccanico. In preparazione alla microscopia, dovrebbe essere preparato in anticipo un grande tampone di 1% di agarosio/TPM/0,2% CTT come descritto nei passaggi 2.1 - 2.3. Si prega anche di consultare la Tabella dei Materiali per i prodotti specifici utilizzati qui.

1. Preparare 500 mL di tampone TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM_{KH, 2}PO₄ pH 7,6, 8 mM_{MgSO 4}) e sterilizzare in autoclave o filtrazione usando un filtro a tappo di bottiglia.

NOTA: Il tampone sterile può essere conservato per diversi mesi a temperatura ambiente.

2. Prepara una soluzione microscopica di agarosio all'1% contenente lo 0,2% di CTT (miscela 1 g di agarosio con 80 mL di tampone TPM e 20 mL di mezzo CTT all'1%). Riscalda in un forno a microonde finché l'agarosio non si fonde.

NOTA: Il CTT dello 0,2% è sufficiente a permettere alle cellule di crescere e prevenire la fame. Concentrazioni più elevate di CTT nel mezzo microscopico portano a un'elevata fluorescenza di fondo.

3. Riempire una piastra di Petri con l'agarosio fuso fino a uno spessore di 0,5 cm (per una piastra di Petri quadrata da 11,5 cm x 11,5 cm, sono necessari circa 60 mL di agarosio fuso) e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.

NOTA: Il tampone di agarosio può essere conservato a 4 °C in un ambiente umido per fino a 2 giorni.

1. Preriscaldare il tampone 1% di agarosio/TPM/0,2% CTT a 32 °C per almeno 15 minuti prima dell'uso.

NOTA: Per preparare le cellule alla microscopia, segui i passaggi 2.4 - 2.8.

4. Posizionare un rivestimento di vetro sterile (60 mm x 22 mm, spessore: 0,7 mm) su una struttura in plastica o metallo con un foro al centro (Figura 1A); Questa cornice funge da supporto meccanico per il sottile copertura e aiuta a ridurre la deriva durante la microscopia. Fissa il sottoveste di copertura al telaio con del nastro adesivo.

1. Per preparare il telaio, si taglia un telaio da 75 mm × 25 mm da una piastra metallica spessa 1 mm, poi si taglia un foro di dimensioni appropriate (20 mm × 30 mm in questo esperimento) al centro.

5. Aggiungere 10 - 20 μL di cellule di M. xanthus cresciute esponenzialmente sul copro.

6. Aggiungere microsfere fluorescenti da 0,5 μm come marcatori fiduciali alle cellule per semplificare il tracciamento di cellule o proteine nelle registrazioni a time-lapse.

1. Diluire le microsfere 1:100 in un tampone TPM e conservare a 4 °C per diversi mesi. Agita accuratamente prima dell'uso e aggiungi 5-10 μL delle microsfere diluite alle cellule.

NOTA: Qui sono state utilizzate microsfere fluorescenti in tutti i canali fluorescenti comuni blu, verde, giallo e rosso.

7. Tagliare un piccolo pad approssimativamente delle dimensioni del coversheet del grande tampone preriscaldato all'1% di agarosio/TPM/0,2% CTT e posizionarlo sopra le celle (Figura 1B). Posizionare un coperchio sopra il tampone di agarosio/TPM/0,2% CTT per prevenire l'evaporazione e mantenere le cellule in un ambiente umido.

NOTA: La sola copertura previene un'evaporazione significativa per almeno 2 ore. Per registrazioni a time-lapse più lunghe, il pad di agarosio/TPM/0,2% CTT e il sandwich coverslip devono essere sigillati con pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione.

8. Incubare il campione di microscopia a 32 °C per 15-20 minuti per permettere alle cellule di attaccarsi al fondo del tampone di agarosio. Poi inizia le registrazioni di microscopia in time-lapse.

Risultati

Figura 1: Schema dell'allestimento sperimentale utilizzato durante tutto lo studio. (A) Un telaio in metallo o plastica funge da supporto per il campione. Un copricapo viene fissato al telaio metallico con del nastro adesivo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMI6000B con AFC	Microsistemi Leica	11888945	Microscopio a fluorescenza a campo ampio invertito automatizzato con controllo adattivo della messa a fuoco
Telaio di montaggio universale	Microsistemi Leica	11532338	Supporto per il palco per diverse dimensioni di campione
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 olio PH3	Microsistemi Leica	11506197	Obiettivo di contrasto di fase
Fotocamera Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Fotocamera sCMOS da 4,0 megapixel per l'acquisizione di immagini
Set di filtri TXR ET, k	Microsistemi Leica	11504170	Set di filtri a fluorescenza, Ex: 560/40 Em: 645/75
Set di filtri L5 ET, k	Microsistemi Leica	11504166	Set di filtri a fluorescenza, es: 480/40 Em: 527/30
Set di filtri YFP ET, k	Microsistemi Leica	11504165	Set filtro a fluorescenza, es: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Priore	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Controller di automazione per microscopio con centro di controllo interattivo
Sorgente luminosa EL 6000	Microsistemi Leica	11504115	Sorgente luminosa esterna a fluorescenza
Incubatore BLX Black	Pecon	11532830	Camera di incubazione nera che circonda il microscopio
Tempcontrol 37-2 digitale	Microsistemi Leica	11521719	Controllo automatico della temperatura per camera di incubazione
Solfato di gentmicina	Carl Roth	233.4	Gentamicina
Ossitetracilina diidrata	Sigma Aldrich	201-212-8	Ossitetraciclina
Solfato di kanamicina	Carl Roth	T832.3	Kanamicina
Filtro Filtropur BT25 0.2 a tappo di bottiglia	Sarstedt	831,822,101	Filtro con tappo per la sterilizzazione dei tamponi
Deckgläser	VWR	630-1592	Spostamento di copertura in vetro (60 x 22 mm, spessore: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agarosio per vetrine microscopiche
Leica Metamorph AF	Microsistemi Leica	11640901	Software di controllo del microscopio e software per l'analisi delle immagini
Microspere Tetraspeck, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Microsfere fluorescenti
Petri	Greiner Bio-one	688102	Piastra di Petri quadrata di 120 mm x 120 mm x 17 mm per cuscinetti di agarosio
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(idrossimetil)-aminometano	Carl Roth	AE15.2	Tris
Solfato di magnesio eptaidrato	Carl Roth	P027.2	Solfato di magnesio
Fosfato diidrogeno di potassio p.a.	Carl Roth	3904.1	Fosfato diidrogeno di potassio
Medio CTT 1%: 1% (p/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM tampone fosfato di potassio pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Mezzo di coltivazione per M. xanthus
Tampone TPM: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM tampone fosfato di potassio pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Tampone per la preparazione di vetrini microscopici per M. xanthus