Analisi precisa e ad alta produttività della crescita batterica utilizzando un lettore di microplacche

Abstract

Fonte: Kurokawa, M., et al. Analisi precisa e ad alto rendimento della crescita batterica. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video dimostra la quantificazione ad alta produttività della crescita batterica utilizzando un lettore di microplacche. Descrive i passaggi coinvolti nella preparazione della coltura, nella misurazione della densità ottica e nell'analisi della dinamica della crescita.

Protocollo

1. Registrazione in tempo reale della crescita
   1. Traccia un pittogramma di piastra a 96 pozzi (tabella 8 × 12) per indicare le posizioni dei campioni di coltura inoculata sulla piastra a 96 pozzi. Stampa la tabella e usala come riferimento per l'esperimento.
      NOTA: I pozzi situati ai bordi della micropiastra dovrebbero contenere solo un mezzo vuoto a causa dell'evaporazione.
   2. Posizionare una micropiastra sterilizzata a fondo piatto a 96 pozzi con coperchio, punte di pipetta P-1000, 1000 μL, P-200, 200 μL, diversi microtubi da 1,5 mL, una pipetta multicanale a 8 canali, un serbatoio di reagente sterilizzato, M63 a temperatura ambiente e le scorte di glicerolo di Escherichia coli su un banco pulito.
   3. Aggiungere circa 25 mL M63 al serbatoio del reagente. Usa questo serbatoio per tutti i passaggi seguenti.
   4. Aggiungere 900 μL M63 ai microtubi in preparazione alla produzione di diluizioni seriali.
   5. Scongela la scorta di glicerolo a temperatura ambiente. Aggiungi 900 μL di M63 alla scorta di glicerolo scongelata e al vortice. Questo comporta una diluizione di 10 volte del stock originale di glicerolo.
   6. Trasferire 100 μL della diluizione a 10 volte in un altro microtubo contenente 900 μL di M63 e vortice. Questo comporta una diluizione di 100 volte.
   7. Ripeti il passo 1.6 fino a raggiungere il numero desiderato di diluizioni.
   8. Riempire i pozzi ai margini della micropiastra con 200 μL M63 utilizzando una pipetta a 8 canali (P-200).
      NOTA: Questi pozzi possono essere usati come blank.
   9. Carica 200 μL di ciascun campione diluito preparato nei passaggi 1.4 - 1.7 ai pozzi delle micropiastre secondo la tabella di riferimento (passo 1.1). Vortice i campioni diluiti prima di caricarli e carica lo stesso campione in più pozzi in diverse posizioni della piastra di qualità.
   10. Posiziona la micropiastra a 96 pozzi sul lettore di piatta.
   11. Apri "Leggi ora" in "Gestione Attività" e scegli il programma. Clicca su "OK" per iniziare a misurare. Salva la registrazione come nuovo file sperimentale per l'analisi dei dati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fosfato di dipotassio	Wako	164-04295
Fosfato monopotassico	Wako	166-04255
Solfato di ammonio	Wako	019-03435
Solfato di magnesio eptaidrato	Wako	138-00415
Tiamina-HCl	Wako	201-00852
Glucosio	Wako	049-31165
Hcl	Wako	080-01066
Solfato di ferro (II) eptaidrato	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Glicerolo	Wako	075-00611
Punte della pipetta, 200 μL	WATSON	110-705Y
Punte della pipetta, 1.000 μL	WATSON	110-8040
Microtubo (1,5 mL)	WATSON	131-715C
8 pipette multicanale	WATSON	NT-8200
Agitatore Pasorina	COME UNO	2-4990-02
Cilindro di vetro (200 mL)	COME UNO	1-8562-07
Misuratore di pH di precisione	COME UNO	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Supporto per microtubi	Biografia BM	801-02Y
Vortice	Biografia BM	BM-V1
Micropiastra Corning Costar a 96 pozzi con coperchio (fondo piatto, trasparente)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Serbatoio del reagente Corning Costar (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
Panca pulita BIO	Panasonic	MCV-B131F
Ceppi batterici	Organizzazione delle banche di stiramento; Progetto Nazionale di Risorse Bio (NBRP) in Giappone