Valutazione dell'attività batterica di chaperone tramite lo spiegamento termico di una proteina modello

Abstract

Fonte: Dahl, J. et al. Rilevamento dell'attività dipendente dal pH di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra un saggio basato su spettrofotometro a fluorescenza per valutare l'attività di chaperone su una proteina del substrato sotto stress acido e termico. Essa delinea i passaggi per monitorare lo sviluppo e l'aggregazione del substrato tramite la diffusione della luce, confrontando le condizioni con e senza il chaperone.

Protocollo

1. Saggio sull'attività del chaperone utilizzando la deidrogenasi malata termodispiegante (MDH)

NOTA: L'influenza dell'HdeB purificato sull'aggregazione della deidrogenasi mitocondriale mitocondriale (MDH) che si svolge termicamente a diversi valori di pH è stata monitorata come descritto di seguito. Tutte le concentrazioni proteiche elencate si riferiscono alla concentrazione di monomeri.

1. Per preparare la MDH, dialisi la MDH a 4 °C durante la notte contro 4 L di tampone C (50 mM fosfato di potassio, 50 mM cloruro di sodio (NaCl), pH 7,5) e concentra la proteina a circa 100 μM utilizzando unità filtranti centrifughe con un limite di peso molecolare di 30 kDa.
   NOTA: È necessaria una dialisi attenta della MDH poiché la MDH viene somministrata come soluzione di solfato di ammonio.
2. Per rimuovere aggregati, centrifugare la proteina per 20 minuti a 20.000 x g a 4 °C. Determinare la concentrazione di MDH tramite assorbanza a 280 nm (ε_{280 nm} = 7.950 ^{M-1 cm-1}). Preparare 50 μl di aliquote di MDH e congelare rapidamente le aliquote per l'archiviazione.
3. Inserire una cuvetta di quarzo da 1 ml in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di portacampioni e agitatori a temperatura controllata. Imposta λ_ex/em a 350 nm.
4. Aggiungere volumi appropriati di tampone D preriscaldato (43 °C) (150 mM fosfato di potassio, 150 mM NaCl) ai valori di pH desiderati (qui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) alla cuvetta e impostare la temperatura nel portacuvette a 43 °C. Il volume totale è di 1.000 μl.
5. Aggiungere 12,5 μM HdeB (o in alternativa, lo stesso volume di buffer di memoria HdeB per il controllo del buffer) al buffer, seguito dall'aggiunta di 0,5 μM MDH. Inizia a monitorare la diffusione della luce. Incubare la reazione per 360 secondi per consentire un adeguato dispiegamento della MDH.
6. Alza il pH a 7 aggiungendo un volume di 0,16-0,34 di 2 M non buffeati_{K 2HPO 4} e continua a registrare la diffusione della luce per altri 440 secondi.
7. Imposta l'entità dell'aggregazione di MDH registrata in assenza del chaperone in un momento definito dopo la neutralizzazione (d'ora in poi 500 secondi, quando è stata osservata la massima diffusione luminosa di MDH) al 100%. Normalizzare l'attività di HdeB al segnale di diffusione luminosa di MDH in assenza di HdeB a ciascun valore di pH indicato.

Materiali