Valutazione del ruolo protettivo di un chaperone attivato da acido nell'E. coli sotto stress acido

Abstract

Fonte: Dahl, J., et al. Rilevamento dell'attività dipendente dal pH di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra l'uso di colture ricombinanti di E. coli per valutare l'effetto protettivo di un accompagnatore attivato da acido durante lo stress acido. Il monitoraggio della crescita batterica rivela una maggiore sopravvivenza nelle colture che esprimono accompagnatori rispetto ai controlli, evidenziando il ruolo degli accompagnatori nella stabilizzazione proteica in condizioni di stress.

Protocollo

1. Effetto della sovraespressione di Chaperone HdeB sulla sopravvivenza di E. coli sotto stress acido

NOTA: Il DNA genomico di E. coli MG1655 è stato isolato utilizzando il protocollo standard.

1. Amplifica la chaperone hdeB da E. coli MG1655 tramite PCR usando primer hdeB-BamH I-rev GGT GGT CTG GGA GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT e hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG ATG ATT TCA TCT CTC CTC C.
2. Impostare la reazione PCR in 50 μl come segue: 10 μl 5x polimerasi buffer, 200 μM dNTP, 0,5 μM primer JUD2, 0,5 μM primer JUD5, 150 ng di DNA genomico MG1655, 0,5 μl DNA polimerasi, aggiungere_{ddH 2}O a 50 μl.
3. Esegui l'amplificazione di hdeB come segue: Passo 1: 5 min a 95 °C, 1 ciclo; Passo 2: 30 secondi a 95 °C, 30 secondi a 55 °C, 30 secondi a 72 °C, 40 cicli; Passo 3: 10 minuti a 72 °C.
4. Clonare il frammento PCR risultante nei siti EcoRI e BamHI del plasmide pBAD18 utilizzando metodi standard per il clonaggio dei siti di restrizione. Purifica il plasmide utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Verifica il plasmide risultante tramite sequenziamento.
5. Trasformare il plasmide che esprime HdeB o il vettore vuoto pBAD18 in ceppo BB7224 (ΔrpoH) (genotipo: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) utilizzando cellule chimicamente competenti.
   NOTA: Questa varietà è sensibile alla temperatura.
6. Dopo uno shock termico di 45 secondi a 42 °C e prima della placcatura, incubare le cellule a 30 °C e 200 giri al minuto. Eseguire striature singole di colonna dei cloni positivi e incubare durante la notte a 30 °C. Preparare una coltura notturna a 50 ml LB_Amp e coltivare le cellule a 200 giri/min e 30 °C.
7. Diluire colture notturne 40 volte in 25 ml LB_Amp e far crescere i batteri in presenza di 0,5% di arabinosio (Ara) a 30 °C e 200 giri/min fino a una _O.D.600nm = 1,0 per indurre l'espressione della proteina HdeB.
8. Per gli esperimenti di spostamento del pH, si usa LB_Amp+Ara per diluire le cellule a una OD _{di 600nm} pari a 0,5 e si aggiutica ai rispettivi valori di pH (qui: pH 2.0, pH 3.0 e pH 4.0) aggiungendo volumi appropriati di 5 M HCl.
9. Dopo i punti di tempo indicati (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralizza le colture aggiungendo i volumi appropriati di 5 M di NaOH.
10. Monitorare la crescita delle colture neutralizzate in coltura liquida per 12 ore a 30 °C utilizzando misurazioni O.D.

Materiali