Estrazione di DNA genomico basata sulla lisi termica da un batterio patogeno

Abstract

Fonte: Gulla, S., et al. Analisi multi-locus a numero variabile Tandem-repeat del batterio patogeno dei pesci Yersinia ruckeri tramite multiplex PCR ed elettroforesi capillare. J. Vis. Esp. (2019).

Questo protocollo estrae DNA genomico da Yersinia ruckeri sospendendo colonie isolate in acqua ultrapura e applicando calore per lisare le cellule. La centrifugazione separa il surnatante contenente DNA dai detriti cellulari, producendo DNA modello adatto alla genotipizzazione basata su PCR e all'analisi epidemiologica.

Protocollo

1. Coltivazione batterica ed estrazione del DNA genomico

1. Seminare colture pure di Y. ruckeri su qualsiasi tipo di agar adatto (gli autori hanno usato agar al 5% di sangue bovino) e incubare a 22 °C per 1-2 giorni, o 15 °C per 3-4 giorni.
2. Da ogni piastra di agar, si sceglie una singola colonia rappresentativa con un anello di inoculazione e si trasferisce in tubi centrifughe da 1,5 mL contenenti 50 μL di acqua ultrapurificata. Sospendere, formare un vortice brevemente e incubare per 7 minuti su un blocco riscaldante a 100 °C.
3. Centrifuga a 16.000 x g per 3 minuti e usa una pipetta per trasferire con cura il surnante in un tubo centrifuga vuoto da 1,5 mL. Procedere al passo successivo usando il sovrantantante come DNA modello o conservare a -20 °C fino a quel momento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatore a 22°C/15°C	Come preferisco.	NA
Centrifuga/e	Come preferisco.	NA
Tubi Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Tubi centrifughe utilizzati durante l'estrazione del DNA.
Congelatore	Come preferisco.	NA
Blocco riscaldante	Come preferisco.	NA
Acqua Milli-Q	NA	NA	Acqua purificata utilizzata durante PCR ed elettroforesi capillare. Ricetta standard; prodotta internamente.
Cultura pura di Yersinia ruckeri	NA	NA	Ad esempio, criopreservato o fresco.
Vortice	Come preferisco.	NA