Rilevamento di patogeni pesci tramite analisi a ripetizione tandem a numero variabile (VNTR)

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Gulla, S., et al. Analisi multi-locus a numero variabile Tandem-repeat del batterio patogeno dei pesci Yersinia ruckeri tramite multiplex PCR ed elettroforesi capillare. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra la procedura per separare gli ampliconi a ripetizione a numero variabile (VNTR) marcati fluorescentemente, derivati da un batterio patogeno dei pesci, utilizzando elettroforesi capillare per generare profili elettroferografici specifici per dimensione per l'identificazione batterica.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Condizioni di installazione e funzionamento dell'elettroforesi capillare

Dopo la conferma degli ampliconi PCR (reazione a catena della polimerasi), diluire i prodotti PCR 1:10 (v/v) in acqua purificata. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
Lavorando in una camera fumi, preparare un volume di master mix composto da 9 μL di formamide e 0,5 μL di dimensione standard per prodotto PCR (permettendo il 10% di volume in surplus). Vortice brevemente e distribuire 9,5 μL nei pozzi su una piastra adatta al sistema CE (elettroforesi capillare) disponibile, prima di aggiungere 0,5 μL di prodotto PCR diluito. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analizzatore Genetico Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Utilizzato per l'analisi di frammenti di elettroforesi capillare.
Moduli BioNumerics7	Matematica applicata	NA	Utilizzato per generare alberi di copertura minima a partire dai dati MLVA.
Centrifuga/e	Come preferisco.	NA
Tubi Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Tubi centrifughe utilizzati durante l'estrazione del DNA.
Congelatore	Come preferisco.	NA
Fumaria	Come preferisco.	NA
Software GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Utilizzato per leggere elettroferogrammi dall'elettroforesi capillare.
Standard standard di dimensione del colorante GeneScan 600 LIZ v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Standard di dimensione utilizzato durante l'elettroforesi capillare.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Formamide deionizzata utilizzata durante l'elettroforesi capillare. Preparate gli aliquout di lavoro.
Acqua Milli-Q	NA	NA	Acqua purificata utilizzata durante PCR ed elettroforesi capillare. Ricetta standard; prodotta internamente.
Multiplex PCR Plus Kit	Qiagen	206151/206152
Ciclatore termico PCR	Come preferisco.	NA
Polimero POP-7 per analizzatori genetici 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matrice di separazione utilizzata durante l'elettroforesi capillare.
Cultura pura Yersinia ruckeri	NA	NA	Ad esempio, criopreservato o fresco.
Acqua priva di RNasi	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR Plus Kit
Buffer tris-borato-EDTA (TBE)	NA	NA	Ricetta standard; prodotta internamente.
Agar di soia tripsina/agar di sangue bovino	NA	NA	Ricetta standard; prodotta internamente.
Vortice	Come preferisco.	NA

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