Esposizione di una comunità batterica orale sintetica a fasi simulate della digestione

Abstract

Fonte: Arroyo, M. C., et al. Valutazione della vitalità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia intestino-microbo ospite-microbo in vitro . J. Vis. Esp. (2018)

Questo video dimostra la valutazione della fattibilità di una comunità microbica orale sintetica durante la digestione simulata orale, gastrica e intestinale. La sopravvivenza batterica viene quantificata dopo ogni fase, rivelando un progressivo declino dovuto allo stress digestivo.

Protocollo

1. Sopravvivenza batterica dopo condizioni di transito gastrointestinale in vitro

NOTA: Prepara fluidi digertivi simulati con le modifiche descritte di seguito. Prepara tutte le diluizioni con acqua ultrapura. Sterilizza tutte le soluzioni tramite un filtro da 0,22 μm ed esegui la procedura di digestione in condizioni sterili.

1. Digestione orale:
   1. Mettere 3 mL della comunità batterica in un tubo sterile da 50 mL, mescolare con 3 mL di liquido salivare simulato (SSF), contenente in millimoli per litro (mmol L⁻¹): cloruro di potassio (KCl), 15,1; Fosfato di monopotassio (KH₂PO₄), 3,7; Bicarbonato di sodio (NaHCO₃), 6,8; Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl₂·6H₂O), 0,5, carbonato di ammonio [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Acido cloridrico (HCl), 1.1; Cloruro di calcio diidrato (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Aggiungi 75 U/mL di α-amilasi dalla saliva umana di tipo IX-A e 2 g/L di mucina dallo stomaco suino (tipo II) all'SSF.
   2. Incuba il composto per 2 minuti a 37 °C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL per l'estrazione del DNA e la quantificazione della citometria di flusso (S1).

2. Digestione gastrica:

1. Aggiungere 4 mL di liquido gastrico simulato (SGF), contenente (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Cloruro di sodio (NaCl), 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Inoltre, l'SGF conteneva 2 g/L di mucina proveniente dallo stomaco suino (Tipo II).
2. Misura il pH e aggiusta a pH 3 con 1 molare (1 M) di HCl, se necessario. Incubare a 37 °C e 100 giri/min. Raccogli un campione da 2 mL (S2).

3. Digestione dell'intestino tenue:

1. Aggiungere 4 mL di liquido intestinale simulato (SIF) contenente (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, al tubo di digestione.
2. Regola a pH 7 con 1 M di idrossido di sodio (NaOH), se necessario. Incubare a 37 °C e 100 giri/min. Raccogli un campione da 2 mL (S3).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mucina da stomaco suino di tipo II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q accademico, sistema ad acqua ultra pura	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker incubatore InnOva 4080	New Brunswick Scientific	8261-30-1007
Acqua priva di nucleasi	Elettroforesi Serva	28539010
Citometro di flusso BD Accuri C6	BD in Biologia	653118
Kit PCRpure InnuPREP	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit di purificazione PCR