Estrazione del DNA genomico da tessuto fogliare vegetale infettato da batteri patogeni

Abstract

Fonte: Gulla, S., et al. Analisi multi-locus a numero variabile Tandem-repeat del batterio patogeno dei pesci Yersinia ruckeri tramite multiplex PCR ed elettroforesi capillare. J. Vis. Esp. (2019).

Questo protocollo estrae DNA genomico da Yersinia ruckeri sospendendo colonie isolate in acqua ultrapura e applicando calore per lisare le cellule. La centrifugazione separa il surnatante contenente DNA dai detriti cellulari, producendo DNA modello adatto alla genotipizzazione basata su PCR e all'analisi epidemiologica.

Protocollo

1. Coltivazione batterica ed estrazione del DNA genomico

1. Seminare colture pure di Y. ruckeri su qualsiasi tipo di agar adatto (gli autori hanno usato agar al 5% di sangue bovino) e incubare a 22 °C per 1-2 giorni, o 15 °C per 3-4 giorni.
2. Da ogni piastra di agar, si sceglie una singola colonia rappresentativa con un anello di inoculazione e si trasferisce in tubi centrifughe da 1,5 mL contenenti 50 μL di acqua ultrapurificata. Sospendere, formare un vortice brevemente e incubare per 7 minuti su un blocco riscaldante a 100 °C.
3. Centrifuga a 16.000 x g per 3 minuti e usa una pipetta per trasferire con cura il surnante in un tubo centrifuga vuoto da 1,5 mL. Procedere al passo successivo usando il sovrantantante come DNA modello o conservare a -20 °C fino a quel momento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di purificazione del DNA genomico Wizard	Promega	A1120	Fonte di lisi dei nuclei, RNasi, precipitazione proteica e soluzioni di reidratazione del DNA
Azoto liquido	Prodotti aerei	N/A
Mastercycler Pro con pannello di controllo	Eppendorf	6321000019
Microonde 1250 W	Panasonic	N/A
Centrifuga da tavolo 5424	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 bagno maria digitale	Fisher scientifico	15-462-15Q
Spatola metallica	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortaio e pestello	Sigma-Aldrich	Z247464
Miscelatore LSE Vortex	Corning	6775
2-propanolo	Sigma-Aldrich	I9516
Punte sterili da 10 μL	Consiglio Una	1161-3730
Punte sterili da 200 μL	Consiglio Una	1163-1730
Punte sterili da 1250 μL	Consiglio Una	1161-1750
Kit Pipettor a Volume Variabile	VWR	75788-460
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarosio	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acido acetico	Fisher Chemical	A38-212
Base Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Biospettrometro di base	Eppendorf	6135000009