Test di sovrapposizione sull'agar morbido per rilevare l'uccisione mediata da batteriocina in Pseudomonas syringae

Abstract

Fonte: Hockett, K. L., e Baltrus, D. A. Uso della tecnica di sovrapposizione a agar morbido per lo screening di composti inibitori prodotti batterici. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video mostra la procedura per rilevare l'uccisione mediata dalla batteriocina individuando il sovrantato di un ceppo donatore indotto da antibiotici su una sovrapposizione di agar morbido contenente un ceppo di test. Le zone trasparenti formate dopo l'incubazione indicano un'inibizione batterica.

Protocollo

1. Preparazione della sovrapposizione e test dei supernatant per l'attività

1. Inoculare una singola colonia di un ceppo di P. syringae da testare per la sensibilità in 3 ml di KB (King's medium B), incubare durante la notte con scuotimento a temperatura ambiente.
2. La mattina seguente, diluire la coltura 1/100 in KB freschi. Incubare per 3-4 ore con agitazione a temperatura ambiente.
3. Prepara agar acquoso sterilizzato autoclavando una sospensione di agar 0,35-0,7% (p/v) in acqua ultrapura.
   NOTA: Un stock di agar d'acqua dolce può essere fuso in un microonde e riutilizzato ripetutamente; Non è necessario preparare una nuova sovrapposizione per ogni esperimento. Se l'agar d'acqua viene riutilizzato, è fondamentale assicurarsi che sia completamente fuso dopo il microonde. Altrimenti, la sovrapposizione avrà una texture granulosa al momento della solidificazione, il che renderà difficile l'interpretazione.
4. Prima dell'utilizzo, mantenere l'agar molle fuso in un bagno d'acqua a 60 °C. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, trasferire 3 ml di agar morbido in un tubo di coltura sterile. Riporta il tubo di coltura nel bagno d'acqua per mantenere lo stato fuso.
5. Per versare la sovrapposizione, lascia prima raffreddare l'agar fuso (dovrebbe sembrare caldo ma non caldo al tatto), ma non lasciarlo solidificare.
6. In un cappuccio sterile, inoculare 100 μl della coltura del ceppo tester nell'agar morbido e nel vortice per mescolarla. Ruota la coltura a mano per 10-15 secondi, poi versa su un agar di fondo (KB agar). Inclina la piastra in tutte le direzioni per assicurarti che l'agar morbido copra uniformemente l'agar inferiore.
   NOTA: L'agar inferiore può essere qualsiasi mezzo solidificato (1,5% agar) su cui la ceppa di prova cresce vigorosamente. Per una piastra di Petri standard di 100 mm di diametro, usa ~20 ml di mezzo fuso. L'agar di fondo può essere preparato con diverse settimane di anticipo (se mantenuto a 4 °C senza asciugare) oppure può essere preparato lo stesso giorno.
7. Copri il piatto e lascialo solidificare per 20-30 minuti. Fai attenzione a non disturbare la piastra mentre si solidifica.
8. Una volta solidificato, applica 2-5 μl di sovrantantante sulla sovrapposizione. Lascia incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente. Osserva e registra i risultati la mattina seguente.
   NOTA: Può essere utile eseguire e individuare da una diluizione seriale del sovrandante. Questo permetterà ai ricercatori di distinguere tra attività di eliminazione di batteriofagi e attività di eliminazione della batteriocina. In questo caso, si raccomanda di eseguire diluizioni 1:5 o 1:10.

Materiali