Isolamento dei batteri adattati allo stress tramite selezione di una singola colonia

Abstract

Fonte: Jeong, H., et al. Procedura per l'evoluzione adattiva in laboratorio dei microrganismi utilizzando un chemostato. J. Vis. Esp. (2016).

Questo video dimostra l'isolamento selettivo e la crescita di batteri adattati allo stress provenienti da una coltura esposta a condizioni di stress prolungate. La coltura viene placcata su agar contenente stressore e viene selezionata una singola colonia per inoculare un mezzo liquido con lo stressore. L'assorbanza viene misurata a intervalli regolari per monitorare la crescita e confermare l'isolamento riuscito dei batteri adattati allo stress.

Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Procurarsi un barattolo chemostat (150-250 ml) o una fiaschetta Erlenmeyer (250 ml) contenente una presa di ingresso e una porta di uscita. Collegare le porte con tubi di silicio, permettendo portate di 10-100 ml/ora. Opzionalmente, utilizza una bocchetta d'aria, una presa di uscita aria e prese di ingresso e uscita dell'acqua a temperatura controllata.
2. Procurati un dispositivo adatto al barattolo chemostato che permetta agitazione e controllo della temperatura (oppure usa un incubatore rotativo a scuotere).
3. Procurarsi due pompe peristaltiche per fornire il mezzo fresco e raccogliere la coltura.
4. Procurarsi un barattolo serbatoio (10-20 L) contenente una porta di uscita media e una presa di ingresso aria.
5. Ottenere tubi di silicio adatti al tasso di diluizione (cioè, diametro diametrale 0,8 mm, intervallo di flusso 0,06-36 ml/min; L/S 13 tubi).

2. Preparazione e sterilizzazione del mezzo

1. Medium iniziale
   1. Sciogliere 0,3 g di glucosio, 0,08 g di cloruro di ammonio (NH₄Cl), 0,05 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,75 g di fosfato di idrogeno disodio diidrato (Na₂HPO_{4,2H 2}O) e 0,3 g di fosfato di idrogeno disodio (KH₂PO₄) in 90 mL di acqua distillata (D.W.) in un barattolo chemostato.
   2. Sigilla il barattolo del chemostat insieme ai tubi usando delle pinze. Non sigillare la bocchetta dell'aria.
   3. Sterilizza il barattolo del chemostat in un'autoclave a 121 °C per 15 minuti. Dopo la sterilizzazione, conserva il barattolo del chemostat a temperatura ambiente.
   4. Sciogliere 0,02 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO_{4,7H 2}O), 0,01 g di cloruro di calcio (CaCl₂) e 0,1 mg di tiamina in 10 mL di d.w. (soluzione A).
   5. Soluzione filtrante A utilizzando una siringa e un filtro per siringa pre-sterilizzato (un filtro per pori da 0,45 μm).
   6. Aggiungi il filtrato A della soluzione al barattolo del chemostrato.
2. Mezzo di sollecitazione
   1. Dissolvere 30 g di glucosio, 8 g di NH₄Cl, 5 g di NaCl, 75 g di_{Na 2}HPO₄·2H₂O, 30 g di_{KH 2}PO₄ e 300 g di succinato disodio esaidrato (Na₂·succinate·_{6H 2}O; lo stressore utilizzato in questo esperimento) in 9,9 L D.W. in un barattolo di riserva.
   2. Sigilla il barattolo del serbatoio insieme al tubo usando delle morsette. Non sigillare la bocchetta dell'aria.
   3. Sterilizza il barattolo serbatoio in un'autoclave a 121 °C per 15 minuti. Dopo la sterilizzazione, conserva il barattolo a temperatura ambiente.
   4. Sciogliere 2 g di MgSO_{4,7H 2}O, 1 g di_{CaCl 2} e 10 mg di tiamina in 100 ml di D.W. (soluzione A).
   5. Soluzione filtrante A con una siringa e un filtro per siringa pre-sterilizzato (un filtro per pori da 0,45 μm).
   6. Aggiungi il filtrato A della soluzione al barattolo del serbatoio.
   7. Collega asepticamente il tubo di silicio sterilizzato al barattolo del serbatoio e collega le pompe peristaltiche.
3. Medio ad alta sollecitazione
   1. Prepara il mezzo come nella sezione 2.2, ma con una concentrazione maggiore di fattore di stress (cioè 3-5 g/L più alta nell'adattamento della succinata).
      Nota: Questo protocollo serve per l'adattamento a uno stress che può essere trasmesso tramite il mezzo. Nel caso di fattori di stress fisici come temperatura, agitazione o illuminazione, la coltivazione dovrebbe essere progettata di conseguenza.

3. Coltivazione iniziale

1. Inoculare una singola colonia di Escherichia coli di tipo selvatico (E. coli) in un provetto da 15 ml contenente 4 ml di mezzo iniziale.
2. Incubare la provetta in un incubatore agitante per 12 ore a 37 °C e 220 giri/min.
3. Trasferire asepticamente 1 ml di precoltura nel barattolo del chemostato.
4. Incubare il barattolo del chemostatico, fornendo aerazione (aria 50 ml/min) e agitazione (200 giri/min), a 37 °C per 6 ore.

4. Adattamento allo stress

1. Collega asepticamente l'estremità del tubo di silicio dalle pompe al barattolo del chemostrato.
2. Avvia la pompa di uscita (10 ml/ora o più) e raccogli la coltura. Nota: La coltura dovrebbe essere in fase esponenziale, tipicamente 4-8 ore dopo la coltivazione iniziale.
3. Controlla la densità ottica (600 nm) della coltura dal tubo di uscita.
4. Avvia la pompa di ingresso (10 ml/ora, corrispondente a una velocità di diluizione di 0,1 ora-1).
5. Controlla la densità ottica della coltura a 600 nm dal tubo di uscita ogni 24 ore.
6. Usa il chemostat per 96 ore (ricambio di 9,6 volte) o più. Se la densità ottica è stabile, si scambia il serbatoio contenente il mezzo ad alta sollecitazione. Se la densità ottica è inferiore a 0,2, fermare la pompa di ingresso per 6 ore. Riavvia la pompa di ingresso e controlla che la densità ottica sia superiore a 0,2.
7. Aumentare gradualmente la concentrazione dello stressore passando a un serbatoio con una concentrazione di stressore più elevata.
8. Prelevare campioni della coltura adattata ogni volta che raggiunge un traguardo (ad esempio, un ceppo adattato a uno stress succinato di 100 g/L) e conservarli per ulteriori analisi genomiche.
9. Per la conservazione del campione, miscela il campione di coltura (0,5 ml) con una soluzione sterilizzata all'80% di glicerolo (0,5 ml) e conservalo a -80 °C. Nota: Se il microrganismo acquisisce la capacità di degradare lo stressore durante il processo di ALE, la concentrazione dello stressore nel barattolo di fermentazione non è la stessa di quella nel serbatoio fresco.

5. Isolamento a singola colonia della deformazione adattata allo stress

1. Prepara un medio in lamiera di agar (1,6% agar) contenente lo stesso stressore e alla stessa concentrazione del mezzo.
2. Impiattare la coltura di uscita (0,1 ml) dal chemostato e incubare a 37 °C per 16 ore.
3. Prendere singole colonie dalla piastra usando uno stuzzicadenti sterile e inocularle in provette da 15 ml contenenti lo stesso fattore di stress e alla stessa concentrazione media del chemostato, e incubare per 6 ore.
4. Trasferire 1 ml di brodo di coltura in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 ml contenente 50 ml di substrato. Raccogli 0,5 ml del brodo di coltura ogni 1 ora e misura la dose a 600 nm. Confrontare il tasso di crescita della deformazione adattata a quello della deformazione di tipo selvatico dato lo stressore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fermentatore a mini-chemostat	Biotron Inc.	-	Prodotto su ordine speciale
Tubi di silicio	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	La dimensione del tubo può variare a seconda della velocità di diluizione e della dimensione del barattolo del fermentatore.
Barattolo serbatoio	Bellco	Bottiglia per la conservazione dei media	20 L
Prodotti chimici	Sigma-Aldrich	-	Grado reagente
Glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	Reagente ACS
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	per la biologia molecolare, adatto alla coltura cellulare, ≥99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	Reagente ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	Reagente ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	Reagente ACS, ≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	Reagente ACS, ≥96%
Tiamina·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	grado reagente, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%