1. Raccolta e stoccaggio di acqua e corallo per l'isolamento microbico
NOTA: È essenziale prendere le coordinate e la temperatura dei siti di campionamento. Se possibile, metadati come salinità, pH, profondità e intensità luminosa possono aiutare a individuare approcci di coltivazione più precisi e a future interpretazioni dei dati. Per risultati affidabili, conserva i campioni per il minor tempo possibile. I microbiomi dell'acqua/corallo possono cambiare notevolmente se i campioni non vengono mantenuti alla temperatura corretta e/o conservati per lunghi periodi. Se la fase di isolamento non viene eseguita immediatamente dopo la raccolta, è fondamentale mantenere i campioni a 4 °C fino alla lavorazione. Più a lungo i campioni vengono conservati, anche a 4 °C, più la comunità microbica cambierà.
- Campiona e conserva l'acqua di mare.
- Raccogliere 500 mL di campioni d'acqua almeno triplicati da ciascun sito di campionamento target. Preferibilmente usa bottiglie sterili con tappi a vite.
- Se si tratta l'acqua immediatamente dopo la preleva, tieni le bottiglie in posizione di RT per un breve intervallo. Se la lavorazione del campione avviene in seguito, mantenere le bottiglie a 4 °C.
- Campiona e conserva il corallo.
- Usa una pinza sterile per tagliare frammenti di corallo dallo stesso sito di campionamento dei campioni d'acqua. Per evitare contaminazioni, tocca i coralli solo con guanti sterili.
- Risciacquare il frammento di corallo campionato utilizzando soluzione salina sterile da 20 mL (3% di NaCl in acqua distillata) o acqua di mare artificiale per eliminare i batteri liberi e debolmente attaccati all'acqua di mare.
- Utilizzando una pinza, inserire ogni frammento di corallo in un contenitore sterile da 250−500 mL con un tappo a vite contenente soluzione salina sterile.
- In laboratorio, usando pinze e pinze sterili, pesare 5 g di frammenti di corallo usando piastre di Petri sterili da 100 mm x 20 mm su una bilancia.
- Trasferire i 5 g di campione di corallo in una malta sterile e macerarlo usando un pestello sterile.
- Utilizzando una spatola sterile, trasferire il campione macerato in una fiaschetta di coltura sterile contenente 45 mL di soluzione sterile di NaCl al 3% e 10−15 sfere di vetro da 5 mm. Usa un po' della soluzione salina sterile da 45 mL per lavare la malta e recuperare la massima quantità di macerato.
- Mantenere le fiaschette sotto agitazione costante (150 x g) per 16 ore alla temperatura dell'acqua del sito di campionamento.
NOTA: Per i coralli di acque poco profonde, la temperatura ottimale varia tra 24 e 28 °C. Questo passaggio staccerà i microrganismi da diversi compartimenti corallini, come quelli attaccati alle cellule ospiti, o quelli che vivono all'interno del tessuto e dello scheletro. Dopo questo passaggio, i macerati di corallo non dovrebbero essere conservati e il passaggio di isolamento deve essere eseguito istantaneamente.
2. Isolamento di batteri sintetici degradanti dell'estrogeno 17a-etinilestradiolo (EE2) dall'acqua di mare e/o dai coralli
- Seleziona batteri.
NOTA: Dopo i passaggi 1.1.2 e 1.2.7, la concentrazione di microrganismi nell'acqua di mare che si sono staccati dai diversi macerati corallini sarà sconosciuta e variabile. Per garantire l'isolamento delle singole colonie microbiche nelle piastre di Petri contenenti substrati agarici, sono necessarie diluizioni seriali.- Esegui diluizioni seriali fino a 10-9 in soluzione salina sterile per campioni di corallo e fino a 10-6 per campioni d'acqua. La pipetta diluisce su e giù 5 volte prima di scartare la punta. Campiona il vortice per 5 secondi ogni volta prima di eseguire la successiva diluizione seriale.
- Pipetta 100 μL di ogni diluizione su piastre di Petri contenenti un mezzo agar di brodo di lisogenesi NaCl al 3% (LB), e impiattale.
NOTA: Usa l'agar marino (MA) come mezzo alternativo. Sono necessari triplice di ogni diluizione per risultati affidabili. - Incubare le piastre per 1−3 giorni alla temperatura desiderata (ad esempio, 26 °C). Controlla le targhe una volta al giorno.
- Seleziona e isola le colonie che presentano morfologie di crescita distinte su nuove placche utilizzando la tecnica delle placche striate. Ripeti questo passaggio tutte le volte necessarie per avere colonie pure che crescano sulle placche.
- Se la procedura non viene proseguita immediatamente al passo 2.3.1, conservare gli isolati a 4 °C o in glicerolo come descritto nella sezione 2.2.
- Prepara le scorte di glicerolo.
NOTA: Questo passaggio è opzionale e può essere utilizzato per la conservazione a lungo termine delle scorte batteriche.- Prendi le singole colonie dalla piastra fresca o dalle piastre conservate a 4 °C e inoculale indipendentemente in 2 mL di mezzo sterile LB.
- Posizionare i tubi sotto agitazione costante (150 x g) a 24−28 °C durante la notte (ON).
- Aggiungi 1 mL delle colture batteriche dello step 2.2.2 e glicerolo sterile fino a una concentrazione finale del 20% per i 2 mL di crioviali.
- Lascia i cryovials ACCESI a 4 °C.
- Posiziona le scorte batteriche gliceroliche a -80 °C fino a quando non servono necessarie.
- Esegui il test di capacità di degradazione EE2.
- Attiva gli isolati nel brodo LB o in medi alternativi. Per questo, scegli una singola colonia dalle piastre fresche o dalla piastra conservata a 4 °C, e inocula 2 mL di mezzo sterile LB. Nel caso si tratti di una scorta di glicerolo, prima si stria su piastre di agar LB e si incuba a 24−28 °C ON per far crescere singole colonie. Posizionare il tubo contenente il mezzo LB inclinato sotto agitazione costante (150 x g) a 24−28 °C ON.
- Dopo la crescita batterica, si blocca le cellule centrifugandole a 8.000 x g per 8 minuti a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante e, pipettando delicatamente su e giù, risospendere le cellule in un volume uguale (2 mL) di acqua salina per lavare il brodo LB rimanente.
- Ripeti il passo 2.3.2 due volte per garantire che non ci siano tracce di fonte di carbonio, risospendendo le cellule in un volume uguale di soluzione salina. Ad esempio, se è stato iniziato con una coltura da 2 mL, si risospendono le cellule in un volume finale di soluzione salina da 2 mL.
- Inoculare le cellule lavate e risospese nel mezzo di coltura Bushnell Haas minimo (BH Broth) contenente EE2 come unica fonte di carbonio.
NOTA: EE2 viene disciolto nell'etanolo a una concentrazione finale di 5 mg/L nel mezzo di coltura. Modifica il tipo di inquinante e/o la concentrazione se necessario. - Valutare la crescita batterica tramite densità ottica a 600 nm e/o colonie che formano unità (CFU) su mezzo agar LB, per 16−72 ore di incubazione.
NOTA: In alternativa, i microrganismi possono essere isolati direttamente su mezzi minimi contenenti EE2 o altri composti come unica fonte di carbonio. Questo passaggio indirizzerebbe la selezione ed eviterebbe una crescita indesiderata.